鸡肝脏脂质转运关键基因的鉴定及表达调控研究

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微粒体甘油三酯转运蛋白(MTTP)是脂质转运蛋白家族(LLTPs)中的一员。在哺乳动物中,MTTP主要参与肝脏内极低密度脂蛋白(VLDL)的装配、分泌等脂质代谢过程,是脂质代谢过程中不可缺少的调控蛋白。有缺陷的MTTP基因会导致人无β-脂蛋白血症的形成。然而,在家禽中,鸡肝脏内MTTP的表达并不随VLDL的升高而升高,表明鸡肝脏VLDL形成及转运不受MTTP基因的调控。本试验以筛选参与鸡肝脏脂蛋白装配和分泌的调控基因为目的,首先利用新一代测序技术对20周龄青年鸡(3只)和30周龄产蛋鸡(3只)的肝脏组织进行转录组测序,通过对转录组数据挖掘、差异表达基因筛选以及新基因结构和功能的生物信息学分析,筛选出了一个与脂质转运相关的新基因,命名为MTTPL基因;随后,对MTTPL进行序列克隆以及生物信息学分析,并探究其在不同组织和不同发育阶段的表达规律,初步分析了MTTPL的功能;在此基础上,以雌激素处理的母鸡以及肝原代细胞为模型,进一步探讨了MTTPL的表达调控规律及其与脂质代谢的关系。主要得到以下结果:1.通过对青年鸡与产蛋鸡肝脏转录组数据的分析、差异基因的筛选以及新基因的结构预测,筛选出了一个可能与脂质转运相关的新基因,命名为MTTPL基因。2.以NCBI中预测的MTTPL m RNA序列为参考序列设计引物,克隆获得了MTTPL的CDS序列并上传至NCBI数据库(Genbank:KT899704);鸡MTTPL、MTTP以及人MTTP氨基酸序列分析表明,鸡MTTPL具有人MTTP所有的结构域和结构位点,包括信号肽、LPN以及LCR结构域,而鸡MTTP无LCR结构域。MTTPL起源进化分析表明,MTTPL与MTTP起源于同一古老基因,且两者具有较高的同源性。因此,推测鸡MTTPL可能具有人MTTP类似的功能。3.为了初步分析MTTPL的功能,利用实时荧光定量PCR技术首先探究了30周龄卢氏鸡MTTPL的组织表达模式,并检测了MTTPL和MTTP在1日龄、10周龄和30周龄(产蛋时期)卢氏鸡特定组织的表达变化。结果显示,MTTPL基因只在肝脏和肾脏组织中特异性表达,且其在肝脏中的表达水平高于在肾脏中的表达水平;伴随着鸡日龄的增加,MTTPL在肝脏和肾脏中的表达呈显著上升趋势(P<0.05),然而MTTP在10周龄和30周龄鸡肝脏中的表达没有显著变化(P>0.05),在肾脏中呈显著下调趋势(P<0.05);这表明参与高产期鸡肝脏脂质转运的基因可能是MTTPL,而不是MTTP。4.以雌激素处理的青年母鸡以及鸡肝原代细胞为模型,检测了不同处理条件下MTTPL、MTTP以及Apo B的表达变化从而进一步探讨了MTTPL的表达调控规律及其与脂质代谢的关系。结果显示,雌激素处理能够显著上调Apo B和MTTPL在肝脏组织和体外培养的肝脏原代细胞中的表达(P<0.05),但没有显著改变MTTP表达;这表明MTTPL可能参与雌激素诱导的脂质代谢中的脂质转运过程。综上所述,随着母鸡的性成熟,其血液中VLDL含量逐步升高,MTTPL在母鸡肝脏中的表达也逐步升高,而MTTP在性成熟前和性成熟后母鸡肝脏中的表达没有显著变化;且雌激素处理母鸡个体和肝原细胞试验表明MTTPL在鸡肝脏中的表达受雌激素正向调控,而MTTP却不受雌激素的显著影响;同时结合MTTPL和MTTP的蛋白结构分析,推测鸡肝脏脂质转运的关键基因可能是MTTPL而不是MTTP。
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