糖皮质激素(Glucocorticoid, GC)是由肾上腺皮质合成和分泌的应激激素,其浓度受下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis, HPA轴)轴的调控。正常生理状态下,糖皮质激素对维持机体神经系统的正常生长发育以及生理和应激状态下内环境的稳定都极为重要。糖皮质激素作为很强的免疫抑制剂参与体内多种代谢过程,调控中枢神经系统的功能。研究证实,应激反应时肾上腺糖皮质激素过度分泌与生殖内分泌疾病密切相关,糖皮质激素能在下丘脑水平扰乱GnRH神经元的正常生理活动,从而抑制其生殖内分泌功能。GC能够通过糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor, GR)介导直接作用于促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)神经元,从而影响GnRH神经元的正常生理活动。下丘脑GnRH神经元上存在GR,同时,应激状态下的糖皮质激素对星形胶质细胞会产生一定影响。星形胶质细胞是神经系统胶质细胞的主要组成部分,近年来的研究发现,星形胶质细胞除了参与中枢神经系统的损伤和神经退行性疾病以及具有巨噬细胞的功能以外,在调控生殖方面也具有重要作用。研究表明,下丘脑星形胶质细胞能够分泌前列腺素E2 (Prostaglandin E2, PGE2)、转化生长因子β(Transforming growth factor-alpha, TGFβ)等活性因子,与GnRH神经元上相应的受体结合,促进GnRH的合成和分泌,控制生殖活动。另外,下丘脑星形胶质细胞还能通过黏合分子和GnRH神经元结合,完成信号转导,促使GnRH神经元分泌GnRH,从而调控生殖活动。但是星形胶质细胞能否直接分泌GnRH来控制生殖活动,还未见报道。本实验采用体外培养的大鼠下丘脑星形胶质细胞,探究糖皮质激素对星形胶质细胞分泌GnRH的调控机制。因此,需要获得较纯的下丘脑星形胶质细胞。实验采用重庆市中药研究所提供的1-3日龄的SD新生大鼠,经过原代细胞的分离培养,在经过多次纯化和传代培养获得纯化率达99%以上的星形胶质细胞。经过以上方法所得的星形胶质细胞可为体外研究提供符合要求的细胞。本实验采用体外培养的符合要求的星形胶质细胞,通过免疫荧光,荧光定量PCR, GnRH ELISA试剂盒检验星形胶质细胞是否分泌GnRH,结果显示星形胶质细胞能够分泌GnRH。为了检验GC对星形胶质细胞(Astrocyte, AST)表达GnRH的影响,本实验通过采用10-6mol/L,10-7mol/L,10-8mol/L的GC刺激培养的AST,分别检测10min、20min、30min、40min时AST GnRH水平,选出最佳时间和浓度。结果发现用10-8mol/L的GC刺激培养的AST,在30min时GnRH的表达量与对照组相比显著升高(P<0.05),该实验浓度和时间为最佳实验浓度和时间。为了检验GC对AST GR的影响,本实验通过采用10-6mol/L,10-7mol/L, 10-8mol/L的GC刺激培养的AST,分别检测10min、20min、30min、40min时AST糖皮质激素受体(GR)水平,结果发现10"8mol/L的GC刺激培养的AST,在40min时AST GR表达量较其他实验组显著升高(P<0.05)。为了研究GC对星形胶质细胞分泌GnRH的调节机制。本实验采用10-8mol/L的牛血清白蛋白偶联的糖皮质激素(BSA-GC),10-6mol/L的糖皮质激素受体拮抗剂RU486,10-8mol/L GC刺激AST,在30min时检测GnRH的水平,结果发现RU486+GC组、GC组和GC+BSA-GC组AST GnRH较对照组显著升高(P<0.05),证明短时间内GC刺激AST分泌GnRH是通过非基因组效应作用。为了了解GC作用的信号转导途径,实验用培养的AST,分别加10μM p38抑制剂SB203580、10μERK-1/-2抑制剂U0126、10μM JNK抑制剂SP600125。GC组加OμM SB203580、U0126和SP600125,继续培养30min后,分别加入10-8mol/L的GC,在10min、20min、30min、40min时测定AST GnRH水平。对照组加入等体积的无水乙醇,在10min、20min、30min、40min时测定AST GnRH水平。结果发现SB203580+GC组和U0126+GC组AST GnRH表达水平较对照组显著下降(P<0.05),SP600125+GC组AST GnRH表达水平变化不明显(P>0.05)。证明GC可以通过p38MAPK、ERK-1/-2MAPK转导路径促进AST GnRH的表达。为了进一步探索GC作用的MAPK信号转导途径是否是PKC-MAPK信号转导途径,实验用培养的AST,加入1μM pkc抑制物星形孢菌素,继续培养30min后,分别加入10-8mol/L的GC,在10min、20min、30min、40min时p38、ERK-1/-2、的磷酸化情况；在10min、20min、30min、40min时测定AST GnRH水平。结果发现加入PKC抑制剂+GC组AST GnRH的分泌较对照组明显降低(P<0.05),证明GC作用的MAPK信号转导途径的上游信号途径和PKC信号转导途径有关。综上所述,该实验可以得到以下结论：1、体外培养的星形胶质细胞表达糖皮质激素受体,为研究糖皮质激素调节星形胶质细胞功能奠定了形态学依据。2、首次发现星形胶质细胞能够分泌GnRH,这为星形胶质细胞调控生殖提供了重要的生理学依据。3、糖皮质激素可通过PKC-MAPK(p38)调节GnRH mRNA表达,通过PKC-MAPK ERK-1/-2)调节其分泌。这为糖皮质激素调节生殖的机制提供了新的理论支持,对理解星形胶质细胞在下丘脑-垂体-卵巢轴中的作用具有重要的生理学意义。