人细小病毒B19(Human parvovirus B19,又称人微小病毒B19,简称B19病毒)是迄今发现的能感染人类的最小的单链线状DNA病毒之一。自1990年我们在国内首次证实我国存在B19病毒感染以来,越来越多的研究揭示我国B19病毒感染可诱发急性再障危象、急性血小板减少性紫癜及孕妇非免疫性流产等疾病,尤其对于免疫功能低下或缺陷患者,因缺乏有效治疗药物,B19病毒持续感染可致慢性贫血,甚至危及生命。因此,在我国乃至世界都需要建立有效的B19病毒防治体系。B19病毒基因存在较大的变异。目前B19病毒分为三种基因型:1型(原型)、2型(类A6-和LaLi-)、3型(V9)。不同基因型的分布存在着地理的差异。欧美等西方国家流行的病毒株大多属于1型,2、3型少见;3型多见于西非。此三型其DNA序列差异约为10%,其中大于20%序列差异位于p6启动子区域。在编码VP1/VP2蛋白的开放阅读框内,2、3型与1型比较,DNA序列变异分别为9%、12%,但氨基酸变异仅为1.1%、1.4%。我们在国家自然科学基金课题(39870021)的资助下,采用基因克隆测序技术,对收集到的中国大陆B19病毒流行株(XA株)进行基因分析,发现我国B19病毒流行株的VP1基因独特区有明显的变异,其基因组一级结构的差异,导致所编码氨基酸的改变,可能影响到B19病毒抗原位点及免疫特性的变化。B19病毒基因的变异可导致病毒毒力、致病机制的改变。VP1基因表达的蛋白与病毒的免疫原性及机体感染后产生保护性抗体密切相关,为建立我国B19病毒感染的防治技术,必须深入研究我国病毒流行株变异基因区表达的蛋白的结构和功能位点的变化。因此本实验通过在原核及真核系统表达B19-XA2株VP1蛋白,研究其空间结构和功能位点的变化及其变化对抗原性的影响,以揭示变异的VP1基因表达蛋白的生物学活性,促进B19病毒分子流行病学、致病机理及预防疫苗的研究。研究目的:本实验目的在于扩增获得B19-XA2 VP1基因全长,构建其原核表达载体,表达融合蛋白。同时构建VP1穿梭载体,在昆虫细胞Sf9中表达VP1蛋白,并以原核及真核表达蛋白为免疫原,免疫动物,制备具有一定敏感性和特异性的抗VP1蛋白的多克隆抗血清,用于检测VP1蛋白的免疫原性。分别以原核及真核表达蛋白为抗原,采用ELISA方法与临床患儿的血清反应,并与德国Parvovirus B19 IgM ELISA Kit检测结果比较,分析表达产物VP1蛋白的反应原性,从而为以后研究VP1蛋白的生物学功能,和B19病毒的防治奠定基础。实验方法:1.获得目的基因自行设计引物,按巢式PCR筛选阳性B19感染标本,自阳性标本中按照常规PCR方法扩增获得长度为2345bp的HPV B19 VP1全长基因(nt2623-nt4968)。2.原核表达重组蛋白将VP1基因克隆入载体pET28(a),构建原核重组表达载体VP1-PET28(a),并在E.coli BL21(DE3)中扩增,通过IPTG诱导表达VP1融合蛋白,SDS-PAGE和Western-blot技术分析蛋白表达情况及初步鉴定表达蛋白。3.真核表达VP1蛋白将VP1基因及载体pFastbac1双酶切、连接、转化入DH10Bac,用抗生素及蓝白斑表型筛选阳性重组体,PCR鉴定,获得含目的基因的重组杆状病毒转移质粒VP1-Bacmid,用脂质体介导法将阳性重组体转入Sf9细胞,扩增病毒,循环冻融和裂解,超速离心,获溶解的蛋白质上清。4.以原核及真核表达的重组蛋白为抗原,免疫家兔,制备抗VP1蛋白的多克隆抗血清,ELISA法检测抗体效价;用重组菌超声裂解上清及转染后Sf9细胞裂解后上清(均含重组VP1蛋白)包被ELISA板,分别与临床患儿的血清反应,并与德国ELISA试剂盒检测结果比较,分析表达产物VP1蛋白的反应原性。实验结果:1.巢式PCR筛选到2份阳性B19感染标本,按照常规PCR方法扩增此2份标本,自其中1份标本获得B19 VP1全长基因(2345bp),将其命名为B19-XA2株。2.原核表达载体VPl-PET28(a)经SalⅠ和XbaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳观察酶切片段分子量与预期结果相符(2345bp),测序结果证实序列完全正确。3.将重组菌VP1-PET28(a)-BL21(DE3)经诱导剂IPTG诱导,可表达分子量约为87kDa的蛋白,经Western-blot鉴定,可与6-His抗体结合,证实为VP1融合蛋白。4.构建穿梭载体VP1-Bacmid,通过抗生素及蓝白斑表型双重筛选阳性重组体,经PCR鉴定,获得含目的基因的重组杆状病毒转移质粒VP1-Bacmid,用脂质体介导法将阳性重组体转入Sf9细胞,细胞出现典型病变,收集病变细胞,裂解后SDS-PAGE显示有分子量87kDa的蛋白表达,与预期分子量一致。5. ELISA检测原核系统表达蛋白刺激后产生抗VP1多克隆抗体效价可达1:12800。真核系统表达蛋白刺激后产生抗体效价可达1:50000。6.以重组杆状病毒表达的VP1蛋白作抗原,与B19病毒阳性血清有反应,其OD值略低于德国ELISA试剂盒检测结果。而大肠杆菌系统表达的重组VP1蛋白作为抗原,与B19病毒感染后阳性血清无反应。结论:1.成功构建了重组人细小病毒B19-XA2株VP1全长基因的E.coli.:VP1-PET28(a)-BL21(DE3)。2.成功构建了人细小病毒B19-XA2株VPl全长基因重组杆状病毒转移质粒VP1-Bacmid,并在昆虫细胞Sf9中成功表达VP1蛋白。3.两种表达系统表达的重组VP1蛋白作为抗原有诱导特异性抗体产生的能力,即具有良好的免疫原性。4. Bac-to-Bac系统表达的VP1蛋白其生物活性更接近天然产物,可用作抗原检测人感染B19病毒后的血清抗体,且与进口试剂盒进行平行比较,初步达到同类试剂盒水平。