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柑橘是世界上种植最广泛的水果之一,中国是主要的柑橘生产国,面积和产量均居世界第一。柑橘鳞皮病毒(Citrus psorosis virus,CPsV)引起的柑橘鳞皮病是一种世界性分布的病毒类病害,主要通过嫁接进行传播。CPsV是蛇形病毒属典型的种,是三分体负单链RNA病毒。CPsV具有两种类型鳞皮病A和鳞皮病B,其中鳞皮病A比较常见,其引起的典型症状为:嫩叶叶脉间出现褪绿斑纹,主干树皮出现鳞片状开裂;鳞皮病B会引起更严重的症状,嫩叶出现橡形叶症状,老叶出现环斑症状,主干和嫰枝出现鳞片状开裂,但是感染鳞皮病A的柑橘植株可以保护植株在次感染鳞皮病B时,不出现鳞皮病B的症状。目前已经公布了一组CPsV的基因组序列,为西班牙的P-121株系。本研究根据NCBI数据库中CPsV外壳蛋白(Coat protein,CP)的基因序列设计了4组特异性检测引物,通过一系列反应条件的优化,筛选并获得1组特异性的检测引物。以感染CPsV的柑橘叶片总RNA为模板,采用一步法RT-LAMP(One-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification),在60℃下反应60 min,扩增产物利用琼脂糖电泳分析,同时对其特异性和灵敏度进行测定。结果表明,建立的RT-LAMP检测体系能特异性扩增CPsV,灵敏度为RT-PCR的10倍。用建立的RT-LAMP方法对258个田间样品进行检测,发现5个样品感染了CPsV,其检测结果与RT-PCR法一致。RT-LAMP法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、反应快速等特点,适合对CPsV样品的快速检测与鉴定。运用转录组测序、RT-PCR和RACE验证,获得了CPsV的5个分离物CHN-1、CHN-2、CHN-3、CHN-HN和CHN-UN21的全基因组。序列分析结果表明,CHN-1、CHN-2、CHN-3、CHN-HN和CHN-UN21的基因组全长大小分别为11282 nt、11279nt、11278 nt、11283 nt和11305 nt,均包含4个开放阅读框。CHN-1、CHN-2、CHN-3、CHN-HN和CHN-UN21之间的MP基因的核苷酸相似性为80.78%~99.37%,编码氨基酸相似性为90.55%~99.16%;与国外CPsV分离物的MP基因核苷酸序列相似性为80.78%~99.79%,其对应氨基酸序列相似性为89.71%~99.58%。CHN-1、CHN-2、CHN-3、CHN-HN和CHN-UN21之间的CP基因的核苷酸相似性为81.44%~99.02%,编码的氨基酸相似性为88.38%~99.32%;与国外CPsV分离物的CP基因核苷酸序列相似性为81.29%~100.00%,其对应氨基酸序列相似性为88.38%~100.00%。基于MP基因和CP基因的系统进化分析显示CHN-1、CHN-2、CHN-3和CHN-HN聚为一簇,CHN-UN21单独聚为一簇。通过序列分析发现CHN-3和CHN-UN21的序列存在较大差异,由于没有CHN-3和CHN-UN21单独侵染的柑橘苗木,为了验证二者是不是在症状上也存在差异,将CHN-3和CHN-UN21的MP基因24 k基因克隆至表达载体TRV中,侵染本氏烟观察症状差异。结果表明,二者在本氏烟上的侵染症状相似,均表现为叶片出现轻微皱缩症状。