CRISPR/Cas9介导gClqR基因缺失对PCV2感染猪组织病变的影响

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dzluzd2009
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猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属,是一种无囊膜包裹的单链环状DNA病毒,其是引起断奶仔猪衰竭综合征的主要病原。有研究表明,在PCV2感染猪肺泡巨噬细胞内,PCV2 Cap通过与宿主蛋白gC1 qR相互作用,激活PI3K/Akt和p38 MAPK信号通路,进而显著促进巨噬细胞中的白介素-10(interleukin-10,IL-10)生成。但是gC1qR在PCV2的体内复制及其导致的病理变化有何种作用?目前并不清楚。本试验拟通过构建靶向于猪gC1qR基因的CRISPR/Cas9重组慢病毒系统,将其感染仔猪后获得部分组织gC1qR基因敲除的仔猪,以PCV2感染部分组织gC1qR基因敲除的仔猪,复制PCV2感染猪模型,阐明gC1qR缺失对PCV2体内复制和诱导病理变化的影响。  研究取得以下实验结果:  1.本试验利用CRISPR/Cas9系统,设计了3个靶向于猪gC1qR基因的gRNA(g113、g229和g246),分别成功构建了3个重组慢病毒rLenti-113、rLenti-229和rLenti-246,将构建好的慢病毒感染PK-15细胞后,嘌呤霉素筛选阳性克隆细胞,western blotting检测和测序鉴定,确定在rLenti-113感染的PK-15细胞中成功获得了一株gC1qR基因敲除的PK-15细胞系。  2.大量包装rLenti-113和rLenti-Blank后,以109 copies感染7日龄仔猪4周后,通过western blotting和免疫组织化学技术鉴定,成功获得了部分肺脏和肺门淋巴结中gC1qR缺失的仔猪,分别以PCV2感染正常仔猪、空白慢病毒感染仔猪和部分组织缺失gC1qR的仔猪,结果发现在正常仔猪和空白慢病毒感染仔猪中成功复制了PCV2感染模型,而在部分组织缺失gC1qR的仔猪中,肺脏和肺门淋巴结中PCV2感染诱导的病理变化减轻。  3.相同剂量的PCV2感染正常仔猪、空白对照仔猪和部分组织缺失gC1qR的仔猪,和空白对照仔猪相比,部分组织缺失gC1qR的仔猪在PCV2感染1周后血清中病毒的拷贝数较低,感染4周后肺门淋巴结中的病毒拷贝数较低,而肺和肝脏中病毒拷贝数的变化不明显;且在部分组织缺失gC1qR仔猪的肺门淋巴结组织中,Cap和Rep的表达降低。  综合以上结果,本研究分别设计了3个靶向于猪gC1qR基因的gRNA,并成功构建了相应的CRISPR/Cas9重组慢病毒,将其分别感染PK-15细胞后确定了rLenti-113能介导靶向gC1qR基因并敲除,将rLenti-113感染仔猪后于肺门淋巴结中敲除了gC1qR基因,以PCV2感染部分组织缺失gC1qR的仔猪,发现在缺失gC1qR的相应组织中PCV2的复制水平降低,导致的病理变化有所减轻,此研究初步明确了gC1qR基因在PCV2的复制和致病过程中的作用,为进一步揭示PCV2致病机制提供了理论依据。
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