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前言PRL-3（phosphatase of regenerating liver-3）是一种蛋白酪氨酸磷酸酶,通过调节蛋白质分子酪氨酸残基的磷酸化调控蛋白质活性,参与多种细胞生命活动。Saha等筛选结直肠原发癌与肝转移灶的差异表达基因时发现,正常结直肠组织、良性腺瘤和结直肠癌原发灶中,PRL-3基本不表达或低表达,而在肝转移灶中均高表达,因此推测,该基因与结直肠癌的转移相关。随后许多学者相继发现PRL-3在乳腺癌、卵巢癌、肠癌、胃癌和肺癌等肿瘤中呈现高表达并与其转移密切相关。但PRL-3的作用底物及分子机制尚不完全清楚。鉴定出PRL-3底物对于理解它们在肿瘤演进中的作用以及作为肿瘤治疗的新靶点是很重要的。VEGF是促进血管形成,增强血管内皮细胞增殖和迁移能力的重要介质。VEGF家族的VEGF-C与其受体VEGFR-3结合后,诱导淋巴管内皮细胞增殖,促进淋巴管形成。VEGF和VEGF-C在肿瘤血管形成和淋巴管形成过程中其重要作用。本课题组以往研究发现:PRL-3在NSCLC组织中存在高表达且与VEGF和VEGF-C的表达以及与NSCLC组织的MVD和LVD数目呈正相关。我们推测PRL-3可能通过促进VEGF、VEGF-C表达分别诱导肺癌组织微血管、淋巴管形成,促进肺癌血行和淋巴结的转移。已有实验证实ERK1/2磷酸化为p-ERK,可以促进VEGF基因转录,调控血管形成。我们探讨PRL-3是否通过ERK1/2磷酸化,从而促进VEGF、VEGF-C表达。材料和方法1、细胞培养肺腺癌A549细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中贴壁生长,37℃,5%CO2条件下培养。待细胞至对数生长期呈单层亚融合状态,加入含不同处理因素的培养液,在不同时间点收取细胞。2、方法2.1 Western Blot法:在收集的细胞或组织内加入裂解液充分裂解,低温高速离心,提取上清为总蛋白。上样蛋白量为60ug。电泳（12%SDS-PAGE凝胶）、转印（50V,120min）、5%正常小牛血清封闭,一抗ERK1/2（1:200）、p-ERK（1:200）,β-actin（1:200）,VEGF（1:100）、VEGF-C（1:200）,4℃孵育过夜,分别与各自对应的二抗（1:2500,chemicon,USA）室温孵育2h,DAB显色,结果经自动电泳凝胶成像分析仪（Chemi Imager 5500,Alpha Innotech,USA）采集,进行灰度值测定。2.2细胞迁移和侵袭能力检测在transwell小室（Corning公司）下室加入600ul含10%小牛血清DMEM培养基,上室中加入100ul无血清DMEM培养基,接种A549细胞数为2.5×104个。37℃、5%C02孵箱中培养6hr后吸尽培养基,PBS清洗后,甲醇室温固定15min,用棉签轻擦掉微孔膜上表面的细胞,苏木素染色,室温干燥过夜。取下微孔膜,置载玻片上,镜下观察。细胞侵袭能力的测定用预冷的无血清培养基以1:7稀释Matrigel（BD Biosciences,USA）加入上室100ul,在室温下放置6h。使用前用培养基重新水化并吸净,其他与迁移实验相同,培养18hr后观察结果。2.3逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）:提取细胞总RNA,按RT-PCR（TaKaRa）试剂盒方法进行反应。PCR产物琼脂糖凝胶电泳进行检测,采用凝胶成像分析系统进行半定量分析。2.4 MTT法测定细胞增殖率的变化,以不含细胞的等体积培养基作对照,重复3次,对数据进行统计学分析。流式细胞仪检测细胞凋亡率,重复3次取均值。细胞免疫荧光染色,观察VEGF（1:100）、VEGF-C（1:200）、ERK1/2（1:200）、p-ERK（1:200）的定位及表达强度。3、统计学分析采用SPSS10.0统计分析软件,P<0.05为有统计学意义。结果1、阻断PRL-3能抑制VEGF、VEGF-C的表达,抑制ERK1/2磷酸化可下调VEGF。用PRL-3抗体封闭PRL-3 24h后,细胞免疫荧光检测结果显示p-ERK、VEGF和VEGF-C的表达均降低。我们进一步用Western和RT-PCR检测加入PRL-3抗体（100ng/mL）封闭后0h,1h,2h,4h,8h,24h,发现VEGF和VEGF-C的mRNA和蛋白表达随封闭时间延长而逐渐下调。加入PRL-3抗体封闭PRL-3后p-ERK蛋白表达逐渐下调,而ERK1/2表达基本不变。为了深入探讨PRL-3调控VEGF和VEGF-C的机制,我们用ERK1/2抑制剂PD98059（20nmol/mL）培养A549细胞。结果显示,加入ERK1/2抑制剂PD98059（20nmol/mL）后VEGF的mRNA和蛋白表达随时间延长明显下调,但是VEGF-C的表达基本保持不变。2、阻断PRL-3、ERK1/2能抑制肺腺癌A549细胞迁移和侵袭能力。细胞迁移能力测定实验结果显示,加入PRL-3抗体组肺腺癌A549细胞的细胞穿透数目（17.67±2.46）,与未加入PRL-3抗体组（37.465±5.32）相比明显减少,差异有统计学意义（t=4.236,P<0.001）;加入ERK1/2抑制剂PD98059组肺腺癌A549细胞的细胞穿透数目（20.54±3.77）,与对照培养组相比,差异有统计学意义（t=3.996,P<0.001）。基质胶侵袭实验结果显示,加入PRL-3抗体组肺腺癌A549细胞的细胞穿透数目（8.546±1.64）,与对照培养组（27±3.325）相比明显减少,差异有统计学意义（t=7.295,P<0.001）;加入ERK1/2抑制剂PD98059组肺腺癌A549细胞的细胞穿透数目（13.875±2.9）,与对照培养组相比明显减少,差异有统计学意义（t=4.52,P<0.001）。3、阻断PRL-3对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡无明显影响。MTT法测定结果显示,用PRL-3抗体培养的肺腺癌A549细胞与对照细胞相比无明显差异（P>0.05）。流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期结果显示,用PRL-3抗体培养的肺腺癌A549细胞与对照细胞相比均无明显差异（P>0.05）。结论1、PRL-3可通过调节ERK1/2磷酸化上调A549细胞表达VEGF;PRL-3可通过调节ERK1/2磷酸化促进细胞迁移和侵袭;2、PRL-3可上调VEGF-C表达,但其上调VEGF-C表达的机制尚不清楚,有待于进一步研究。