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背景:免疫力低下在祖国医学看来多属于肾阳虚的范畴,以温阳补肾固卫气的根本出发对治疗临床上免疫力低下的患者有较好的疗效,尤其是对白血病患者,可以减轻白血病患者因药物产生的副作用和免疫抑制。细胞免疫治疗是新兴的肿瘤治疗手段之一,其通过各种生物技术手段在体外对免疫活性细胞进行改造,扩增后再回输到患者体内,进而达到提高患者免疫力,同时抑制或杀死肿瘤细胞的目的。此外在现代医学治疗白血病中小分子抑制剂占了重要一席,尤其是酪氨酸酶抑制剂,自伊马替尼诞生以来大大改变了慢性粒细胞白血病的治疗方式。许多中药或有药用作用的植物药对白血病细胞具有一定的杀伤作用,尽管已经报道了很多有治疗效果的小分子,但诸多药物中存在的小分子对白血病细胞的作用我们仍然不清楚。前期的临床实践证明补阳中药方剂有助于提升肾阳虚患者免疫力和白血病预后的线索,但方剂中的主要活性成分和起重要作用的中药我们对此知之甚少。同时诸多药用植物在民间被用来抗肿瘤,但其中起抗肿瘤作用的活性分子我们也仍然不清楚。因此本课题围绕补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫细胞的调节及活性成分分析和新型小分子抗白血病细胞的筛选来开展。目的:(1)探索中药补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫系统的调节作用为临床用药提供基础研究数据。(2)通过对补肾回阳方中的主要活性成分单体解析使得对该方剂的认识更加深入。(3)筛选出药用植物中具有抗白血病细胞的新型天然小分子为后续工作打下基础。方法:(1)补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫细胞的调节作用:通过腹腔注射25mg/kg氢化可的松,建立肾阳虚小鼠模型,对照组每日腹腔注射等量生理盐水,各组连续给药10天后,检测肾阳虚模型组和对照组小鼠的一般体征、外周血象、以及T淋巴细胞亚群等指标。随后给予肾阳虚模型小鼠补肾回阳方0.25ml/天灌胃治疗,模型对照组和空白对照组用生理盐水灌胃,一天一次,连续给药15天。治疗结束后检测小鼠的一般体征、外周血的相关免疫细胞,和通过流式细胞术测定各组小鼠的外周血、骨髓和脾脏的CD3~+、CD3~-NK1.1~+、CD3~+NK1.1~+的占比水平;以及分离小鼠外周血单核细胞进行后期细胞因子诱导培养DC细胞,检测其体外扩增情况,最后进行数据统计分析。(2)补肾回阳方的活性成分法分析:将补肾回阳方的浓缩液和标准品进行高效液相色谱分析和液质色谱串联分析,通过对比标准品和数据库来探索补肾回阳方中的活性成分。(3)新型小分子抗白血病细胞作用的:将分离得到的新型小分子化合物进行CCK-8药敏实验,筛选对白血病细胞有抑制作用的小分子。结果:(1)补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫细胞的调节作用:中药灌胃治疗后,与模型对照组相比补肾回阳组小鼠的体重增长明显;外周血中白细胞和淋巴细胞水平明显上升;外周血、骨髓和脾脏中的CD3~+、CD3~-NK1.1~+、CD3~+NK1.1~+的占比水平明显提高;经过补肾回阳方灌胃治疗的肾阳虚模型小鼠,由外周血分离单核细胞经体外细胞因子诱导培养的DC细胞,细胞数量也明显高于模型对照组。(2)补肾回阳方的活性成分分析:结合标准品和数据库分析得到补肾回阳方中含有甘草苷、淫羊藿苷、次乌头碱三种物质,此外还得到与淫羊藿成分:异槲皮素、淫羊藿次苷II、淫羊藿苷A、淫羊藿次苷D2;炙甘草成分:甘草素、芹糖甘草苷、甘草黄酮C、甘草次酸;干姜成分:6-姜烯酚、6-姜辣素;肉桂成分:桂皮醛分子式和分子量一致的11种物质。(3)YWF-10、YHL-14、YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7、DX-15小分子对THP-1、Jurkat、KG-1三种细胞均有抑制作用,其中YHL-14、YWF-08两种小分子对32D细胞的抑制作用没有统计学差异(P>0.05),但对KG-1、THP-1的抑制作用有统计学差异(P<0.01),并且YWF-08对Jurkat细胞也有较强的抑制作用(P<0.001)。YWF-10、YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7五种小分子对Jurkat细胞的抑制率远高于对其他细胞的抑制率;相比于对32D细胞的抑制率Jurkat细胞的抑制率也远大于对32D细胞的抑制率。结论:(1)补肾回阳方可以提升肾阳虚小鼠外周血中的白细胞和淋巴细胞数量,可以提高外周血、骨髓和脾脏中的CD3~+、CD3~-NK1.1~+、CD3~+NK1.1~+的占比水平,以及可以提高DC细胞的体外诱导培养数量,证明补肾回阳方对肾阳虚小鼠具有增强和恢复免疫的功效。(2)补肾回阳方中含有甘草苷、淫羊藿苷、次乌头碱三种物质,此外含有与异槲皮素、淫羊藿次苷II、淫羊藿苷A、淫羊藿次苷D2、甘草素、芹糖甘草苷、甘草黄酮C、甘草次酸、6-姜烯酚、6-姜辣素、桂皮醛分子式和分子量一致的物质11种,其中淫羊藿和炙甘草的活性成分最多,鉴于前人的研究和本研究结果在补肾回阳方对免疫的正向调节作用中淫羊藿和炙甘草发挥了要作用。(3)YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7五种小分子对Jurkat细胞的抑制率远高于对其他细胞的抑制率;其中YHL-14、YWF-08两种小分子对32D细胞没有抑制作用,但对KG-1细胞和THP-1细胞有较强的抑制作用。