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本文以副溶血弧菌为抗原免疫产蛋母鸡,从鸡卵黄中提取免疫球蛋白,建立抗体的效价检测方法,并研究母鸡的免疫应答,以及抗体的分离纯化方法、稳定性和体外抑菌效果。
首先,制备副溶血性弧菌免疫原,将供试母鸡分为两组,设置高、低剂量组免疫两组母鸡,高剂量组抗原浓度为5×10<8>cfu/mL,低剂量组抗原浓度为5×10<7>cfu/mL。结果表明,接受免疫的所有母鸡均产生免疫应答,免疫成功率为100%。用建立的ELISA方法跟踪检测免疫鸡蛋的效价,高、低剂量组最高效价分别为1:57600和1:28800:低剂量组抗体效价可维持250天,高剂量组抗体效价可维持300天以上。
通过对IgY的分离纯化条件研究发现,用水稀释法初步分离卵黄中的可溶性蛋白,稀释倍数为9倍,pH为5.2时分离效果较好;乙醇分级沉淀抗体的较佳条件是抗体溶液:95%乙醇(V:V)为10:3.5;经过DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析和SephadexG-100凝胶层析连续纯化后可得到电泳纯的抗副溶血弧菌:IgY,用SDS-PAGE测得组成该抗体的两个亚基的分子质量分别为65900 Da和26500 Da。
通过对抗副溶血弧菌IgY的稳定性研究发现,卵黄水提液和纯化后IgY在60℃处理时,活性都没有明显变化,当处理温度达到75℃时,抗体的活性随着处理时间的延长而急剧降低。对于纯化后的IgY溶液,65℃处理时对抗体活性的影响很小,处理2h后仍有84%;70℃处理时,抗体活性有一定的下降,处理2h后还有67%。卵黄水提液受温度的影响比纯化后的抗体更为明显,65℃处理2h后还有73%;70℃处理处理2h后只有46%。试验结果表明,卵黄抗体在70℃以上时容易发生热变性。
IgY在pH<3或pH>12时会发生变性,而在pH3~11时活性稳定。
胃蛋白酶和胰蛋白酶对抗副溶血弧菌IgY的活性保持均有不利作用,在pH2时胃蛋白酶对抗副溶血弧菌IgY的活性影响很大,处理1h后活性保留率仅有12%,处理2h后抗体己经完全失活;而在pH4时胃蛋白酶对抗副溶血弧菌IgY的影响相对较小,处理8h后活性保留率约为71%。胰蛋白酶对抗副溶血弧菌IgY的活性影响也比较大,处理8h后活性保留率还有51%。IgY对胆盐有较好的耐受性,处理8h后的活性保留率约为90%。冻融对抗副溶血弧菌IgY的活性影响不大,反复冻融6次后,IgY的活性基本没有变化。冷冻干燥会使抗体损失近20%的活性。抗副溶血弧菌IgY溶液及其冻干粉在-20℃保存5个月后活性没有明显的改变;贮存在25℃以上时,抗体活性将随贮存时间的延长而快速下降;冷冻干燥后抗体,贮存于4℃即可在长时间内保持较高的活性,而抗体溶液贮存于4℃时活性有一定的下降。
体外抑菌试验结果表明,抗副溶血弧菌IgY能抑制副溶血弧菌的生长繁殖,当抗体浓度大于5mg/mL时,可对副溶血弧菌有明显的抑菌作用。