【摘 要】
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维生素C（抗坏血酸）是天然的水溶性小分子和细胞内重要的电子供体。早期研究已经揭示,维生素C通过清除氧自由基来帮助机体应对氧化应激。课题组前期研究已经证明,维生素C以信号分子的形式,通过其受体样转运蛋白SVCT2激活细胞内的JAK/STAT信号通路。丝裂原激活的蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）途径与细胞增殖、分化、迁移、衰老和凋亡等过程相关,是细胞中关键的信号通路。目前已经有多项研究
【基金项目】
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中国国家自然科学基金（编号:31572405和31172279）； 陕西省重点科技创新团队计划项目（编号:2014KCT-26）；
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维生素C（抗坏血酸）是天然的水溶性小分子和细胞内重要的电子供体。早期研究已经揭示,维生素C通过清除氧自由基来帮助机体应对氧化应激。课题组前期研究已经证明,维生素C以信号分子的形式,通过其受体样转运蛋白SVCT2激活细胞内的JAK/STAT信号通路。丝裂原激活的蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）途径与细胞增殖、分化、迁移、衰老和凋亡等过程相关,是细胞中关键的信号通路。目前已经有多项研究表明,维生素C通过激活MAPK/ERK信号通路,影响细胞的多项生命活动,但维生素C激活MAPK/ERK信号通路的机制并不清楚。本研究以F9细胞、HEK293T细胞、B16-F10细胞为研究对象,探究维生素C通过其受体SVCT2诱导细胞内MAPK/ERK信号通路的主要分子机制和维生素C-MAPK/ERK信号通路对小鼠黑色素瘤的影响,主要研究内容如下:1.维生素C对MAPK/ERK信号通路的影响。首先,通过Western Blot、双荧光素酶报告实验,检测了不同浓度的维生素C和不同处理时间对细胞中ERK1/2激活的情况,发现一定浓度的维生素C可以在20 min内诱导ERK1/2激活达到峰值,而较高浓度的维生素C会在极短时间内迅速激活ERK1/2。2.SVCT2对维生素C-MAPK/ERK信号通路的影响。通过双荧光素酶报告、RNA干扰和蛋白质过表达实验,确定了SVCT2可以促进维生素C对MAPK/ERK信号通路的激活;然后通过氨基酸定点突变、高效液相色谱和微量热泳动法等技术证实了维生素C激活MAPK/ERK信号通路依赖于维生素C与SVCT2的结合,而不依赖于维生素C的运输。3.SVCT2介导的维生素C激活MAPK/ERK信号通路的分子机制研究。首先通过Western Blot和免疫共沉淀等手段,发现了SVCT2可以招募MAPK/ERK信号通路中的关键蛋白——GRB2和ERK1;然后通过蛋白质免疫沉淀和荧光共振能量转移技术,研究了维生素C的跨膜运输促进SVCT2低聚化,导致JAK2的激活,从而磷酸化GRB2第160位酪氨酸、促进GRB2二聚体解离,最终导致MAPK/ERK信号通路的进一步激活。4.维生素C-MAPK/ERK信号通路对小鼠原位黑色素瘤的影响。首先在B16-F10细胞中,通过Western Blot技术验证了一定浓度的维生素C激活ERK1/2、而高浓度的维生素C抑制ERK1/2;然后在B16-F10细胞诱导的小鼠原位黑色素瘤荷瘤小鼠模型中,研究了腹腔注射高浓度抗坏血酸钠可以通过抑制ERK1/2来抑制小鼠原位黑色素瘤。综上,本研究在实验室前期结果的基础上,进一步表明SVCT2是维生素C的受体,及其介导了维生素C-MAPK/ERK信号通路的激活;揭示了维生素C诱导的MAPK/ERK信号通路和JAK2信号通路之间的相互作用机制,并证明高浓度抗坏血酸钠对小鼠黑色素瘤的抑制作用依赖MAPK/ERK信号途径。
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