乳腺癌是全球女性患者最常见的癌症,尽管由于早期诊断、根治性手术和辅助治疗的发展使得乳腺癌患者的预后有所改善,但乳腺癌仍然是全世界女性癌症死亡的主要原因。乳腺癌患者的高死亡率与远端器官(如骨,肺,脑和肝脏)的复发和转移发展有关,由于转移的肿瘤细胞和转移灶部位微环境特性对现有疗法产生抗性,常规治疗对大部分转移性乳腺癌病人无效。因此,我们迫切需要基于转移病灶的生物学特性和分子机制开发新的诊断和治疗策略。肿瘤转移是多步骤的复杂过程,包括肿瘤细胞从原发灶脱落,经过上皮-间质转化获得基质细胞特性后,穿透周围的细胞外基质(ECM)和基质细胞层,渗入机体脉管系统并进入机体循环系统,随后向远处游走和浸润以及开始转移定植。关于乳腺癌转移的研究,前期已经明确了编码基因驱动乳腺癌非随机性的转移到不同远处器官的特定模式。但是,我们和其他课题组的研究发现,长链非编码RNA(lncRNA)也可以调节乳腺癌细胞向肺、骨、脑、肝和淋巴转移。值得一提的是,在临床前治疗模型中,锁核酸(LNAs)以及纳米颗粒包被siRNA可以靶向干涉异常lncRNAs的表达,显示出其潜在的治疗价值,而这将推动我们进一步探索非编码RNA的临床价值。环状RNA(circRNA)是一类新型的内源性非编码RNA,其可在真核生物中调控基因的表达。它们是由上游剪接受体和下游剪接供体通过经典剪接体介导的剪切或套索剪接而来,并且以共价闭环结构存在,既没有5’端帽结构也没有3’端多聚腺苷酸尾,因而可以拮抗RNA酶R的水解作用。此外,circRNA在细胞和组织中呈现特异性的表达,并且与其线性形式相比,circRNA的表达具有高度稳定性。越来越多的证据表明,circRNA可以通过充当microRNAs(miRNAs)海绵体,作为蛋白质诱饵、剪接调控因子和转录调节因子等途径参与多种生理和病理生理过程。最近,已经有研究显示circRNA参与调控包括乳腺癌在内的不同癌症的发生发展。然而,在乳腺癌非随机性转移中circRNA的表达谱、功能和调控仍有待确定。在本次研究中,我们通过分析三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231亲本株(231-Par)及其同源并具有转移倾向的细胞(肺转移细胞LM2,脑转移细胞BM6和骨转移细胞1833)的circRNA表达芯片谱,筛选并鉴定出一新的环状RNAcircIRAK3,其来源于编码基因IRAK3外显子。circIRAK3在转移性乳腺癌细胞中的表达显著上调且与乳腺癌患者的远处复发及预后密切相关。随后我们深入研究了circIRAK3对乳腺癌细胞迁移和浸润的影响及分子机制,并利用动物模型加以验证,以探讨circIRAK3作为预测乳腺癌患者转移的潜在生物标志物的分子基础。目的:研究circIRAK3调控乳腺癌转移的分子机制,为乳腺癌患者寻找预测乳腺癌转移的分子标志物及治疗靶点。方法:(1)通过circRNA芯片分析4株细胞中circRNA的差异表达,筛选候选circRNA;(2)qRT-PCR检测候选circRNA在乳腺癌细胞及组织中的表达差异;(3)通过核质分离、FISH和RNase R处理等实验分析circIRAK3的基本特性;(4)构建circIRAK3高低表达的稳定细胞株进行表型验证,包括(1)体外细胞模型:迁移、侵袭(Transwell、划痕),增殖(cck-8、细胞克隆形成实验),细胞周期(流式细胞技术);(2)体内动物模型:尾静脉注射LM2稳定细胞株构建乳腺癌被动肺转移模型,通过活体成像观察乳腺癌体内转移情况,转移灶病理切片了解肿瘤转移程度;(5)利用RNA测序和生物信息学预测的方法寻找circIRAK3可能的下游靶基因,并通过双荧光素酶报告基因、RIP实验验证各分子间相互作用,Western blot和qRT-PCR验证上下游调控关系;(6)在乳腺癌细胞中同时转染circIRAK3高表达质粒和miR-3607 mimic或FOXC1干扰RNA,通过Transwell回复实验验证circIRAK3促进乳腺癌细胞迁移的调控网络,使用qRT-PCR检测circIRAK3、miR-3607和FOXC1的表达改变;(7)通过双荧光素酶报告基因、ChIP实验分析FOXC1与IRAK3启动子区域的结合,Western blot和qRT-PCR验证FOXC1对circIRAK3的调控;(8)qRT-PCR和免疫组化检测动物模型肺部转移灶中FOXC1及MMP7的表达情况,明确circIRAK3的调控机制。结果:1、circIRAK3可以作为乳腺癌转移的生物标记物比对231-Par、LM2、BM6及1833细胞的circRNA表达谱芯片,选出在3株转移细胞中均高表达且丰度最高的circIRAK3作为候选环状RNA。qRT-PCR实验证实circIRAK3在乳腺癌远端转移细胞中的表达高于其亲本株细胞,且circIRAK3在35个乳腺癌患者的癌组织中的表达高于癌旁。另外,我们在临床人群样本中检测了circIRAK3的表达,发现在后期出现脑、肺、肝脏及中枢神经系统等远处器官转移复发的乳腺癌患者的原发灶中circIRAK3表达水平明显高于原位复发的患者,而且circIRAK3表达越高的患者复发时间越短。2、circIRAK3的生物学特性碱基测序确认circIRAK3由IRAK3 mRNA上的第2至8号外显子连续环化而成。circIRAK3在RNase R及放线菌酮D的处理下较其线性形式更加稳定。通过核质分离及RNA FISH实验证实circIRAK3主要定位于细胞质中。3、circIRAK3促进乳腺癌细胞迁移干扰LM2、BM6细胞中circIRAK3的表达水平后,细胞的迁移侵袭以及划痕愈合能力明显减弱,高表达231-Par细胞中circIRAK3的表达后细胞迁移侵袭及划痕愈合能力明显增强。而线性IRAK3的表达水平对细胞迁移能力并无影响。4、circIRAK3吸附miR-3607靶向FOXC1利用circIRAK3稳定低表达细胞株及对照细胞株进行基因测序获取受circIRAK3调控的下游靶基因,以及通过生物信息学预测的方法寻找到与circIRAK3可能结合的包括miR-3607在内的8个miRNAs。将此8个miRNAs可能结合的靶基因与测序获取的circIRAK3正向调节的靶基因取交集得到包括FOXC1在内的7个候选基因。目前已有文献证实了FOXC1对乳腺癌转移的促进作用,故将FOXC1作为研究对象。双荧光素酶报告基因实验发现miR-3607只能降低circIRAK3和FOXC1野生型质粒的荧光素酶活性,对突变型质粒的荧光素酶活性无影响,而RIP实验进一步证实circIRAK3与miR-3607结合。另外,qRT-PCR和Western blot检测结果显示miR-3607能明显抑制FOXC1 mRNA和蛋白的表达。5、circIRAK3吸附miR-3607上调FOXC1促进细胞迁移Western blot和qRT-PCR检测结果显示乳腺癌转移细胞中FOXC1的蛋白和mRNA的水平高于原位乳腺癌细胞,在检测的35对乳腺癌及癌旁组织中FOXC1在乳腺癌中的表达高于癌旁,且在35对乳腺癌组织中FOXC1的表达水平与circIRAK3呈正相关。另外,在乳腺癌细胞中circIRAK3能明显上调FOXC1及其下游分子的蛋白水平。回复实验用siRNA敲减FOXC1或者miRNA mimic过表达miR-3607可以逆转circIRAK3对乳腺癌细胞迁移的促进作用。此外,qRTPCR分析显示过表达miR-3607可以逆转circIRAK3对FOXC1的上调。6、转录因子FOXC1正反馈调节circIRAK3在回复试验中共同转染circIRAK3高表达质粒和FOXC1 siRNA后发现FOXC1的敲减可以减弱circIRAK3高表达质粒对circIRAK3表达水平的上调作用。qRT-PCR检测结果也显示FOXC1可以上调IRAK3和circIRAK3的表达水平。而基因IRAK3的启动子区域有转录因子FOXC1的结合元件,通过双荧光素酶报告基因实验发现FOXC1可以升高IRAK3启动子活性,ChIP实验进一步证实FOXC1与IRAK3启动子区域的结合。7、circIRAK3促进乳腺癌转移构建裸鼠乳腺癌转移体内模型,小鼠肿瘤转移的活体荧光检测及病理切片HE染色结果显示,敲降circIRAK3表达水平后乳腺癌肺转移较之对照组明显减弱。免疫组化检测结果显示干扰circIRAK3表达水平后,裸鼠肺转移灶中FOXC1和MMP7的表达水平也明显降低。结论:以上结果提示circIRAK3促进乳腺癌的转移,其机制主要是通过吸附miR-3607减缓其对下游FOXC1的抑制作用,同时上调的FOXC1还作为转录因子正反馈调节circIRAK3的表达水平,从而进一步影响乳腺癌细胞的迁移和侵袭,促进乳腺癌的复发及转移。