凝血是机体重要的生理防御过程，但病理性血栓严重危害着人类健康。当前，心脑血管血栓性疾病发病率逐年上升，每1000人中有1~3人发生不同形式的血栓性疾病。目前国内外临床使用的主要抗凝血药物是普通肝素、低分子肝素、华法林等，这些药物存在导致血小板减少、出血等副作用或起效较慢等缺点。而肽类抗凝血药物，如水蛭素，具有起效快、副作用较低等突出优点，是今后抗凝血药的重点发展方向。菲牛蛭是一味天然传统中药，具有抗凝血、降血脂、抗肿瘤和保护心脑血管等功效，有“软黄金”之称，是天然水蛭素的主要来源。本论文以菲牛蛭为主要原料，系统研究了菲牛蛭蛋白的酶解反应及产物活性与疏水性的关系。本研究不仅极具理论价值，且为安全、绿色的高抗凝血活性的新型抗凝血药研发提供了新途径。针对目前体外抗凝血活性测定方法受环境因素和人为因素影响较大的问题，首先对体外抗凝血活性方法进行了改进，优化了测定过程中几个显著影响条件：(1)样品肽最佳稀释浓度应为10~15mg/mL，滴定次数控制在4次以内的结果为准；超过4次需稀释一倍；(2)最佳反应体系pH为7.0；(3)测定时将凝血酶保存在0℃环境中；（4）在体外抗凝血活性测定过程中，纤维蛋白原溶液配置后有效时间为0-4h。通过考察反应水解度、产物抗凝血活性和可溶性肽得率这3个指标表明，碱性蛋白酶Alcalase AF2.4L对菲牛蛭匀浆液的水解效果最佳，并且反应的最佳工艺条件为：底物浓度12%、酶解温度55℃、酶解时间2h及pH8.5；在此条件下，所得菲牛蛭肽抗凝血活性可达702ATU/g，反应水解度为21.34%，可溶性肽得率达到86.22%；该酶解产物分子量分布范围在700.315~4472.065Da。选用胃蛋白酶和胰蛋白酶对酶解产物模拟体外消化实验结果表明，处理后产物的抗凝血活性相比于酶解产物分别减少5.18%和7.26%，可认为消化酶的处理对活性并无显著影响。为探讨菲牛蛭抗凝血肽活性与疏水性的关系，选用大孔吸附树脂层析分离纯化了酶解产物。通过静态吸附和解吸实验，DA201-C树脂对酶解产物的吸附量和吸附率均最高，分别达358.40mg/g树脂和71.68%，而在75%乙醇中的解吸率可达到81.39%。DA201-C树脂对菲牛蛭抗凝血肽动态吸附的最优条件为：吸附流速为60mL/h、上样浓度为20mg/mL。分别采用不同浓度乙醇作为洗脱剂，对酶解产物分级洗脱，不同组分的疏水值随着洗脱剂中乙醇浓度增加而递增，再比较不同洗脱组分的抗凝血活性，75%浓度乙醇的洗脱组分T3-75对应的抗凝血活性最高，25%浓度洗脱组分T3-25抗凝血活性则最低，分别为830ATU/g和324ATU/g，表明抗凝血活性总体上随肽疏水值和疏水性氨基酸含量增大而增强，即抗凝血活性与肽疏水性呈正相关。考虑到菲牛蛭价格较高，为寻求低成本原料抗凝血肽的开发，选择三种廉价原料——地龙、宽体金线蛭和猪小肠，分别采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和Alcalase AF2.4L酶水解制备抗凝血活性肽，结果显示：胰蛋白酶对地龙粉水解制备的抗凝血肽活性最强，达到554ATU/g；Alcalase AF2.4L酶对宽体金线蛭粉和猪小肠匀浆液水解制备的抗凝血肽活性均最强，分别达到444和400ATU/g。三种原料抗凝血肽活性与菲牛蛭抗凝血肽相比要低一些，且差距较小，证明利用廉价原料——地龙和猪小肠酶解制备抗凝血肽是可行的，此外不可产水蛭素的宽体金线蛭通过酶解躯体依然可以得到活性较高的抗凝血肽。