产腺苷甲硫氨酸工程菌的构建及其合成SAM工艺的优化

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S-腺苷甲硫氨酸作为一种辅因子参与多种生化代谢反应,在生物体内具有转甲基、转硫和转氨丙基作用。SAM可用于治疗肝部疾病、抑郁症、关节炎等多种疾病,因此具有广阔的应用市场。本论文内容主要包括酿酒酵母sam2基因在雅致放射毛霉菌中的克隆表达、响应面优化重组雅致放射毛霉SAM合成工艺及酿酒酵母sam2和apt1基因同时在雅致放射毛霉菌内的克隆表达。综述了 SAM结构、理化性质、临床研究及SAM的制备方法,并对丝状真菌基因工程进行简单的介绍。以一株具有转化腺嘌呤生产ATP能力的野生型雅致放射毛霉为出发菌株,PCR扩增酿酒酵母腺苷甲硫氨酸合成酶sam2,sam2整合至含强启动子Pgpd的整合型质粒pCB1 004-Pgpd的相应位点,构建重组质粒pCB1 004-Pgpd-sam2;重组质粒通过PEG-CaCl2转化至雅致放射毛霉原生质体,使目的基因sam2整合至雅致放射毛霉基因组上,通过抗性和产量筛选获得高产SAM工程菌株。其SAM产量从出发菌株ZGB1的0.40 g/L提高至1.00 g/L,提高了 1.50倍。通过响应面方法优化重组雅致放射毛霉工程菌SAM的合成工艺,确定其最佳转化工艺条件:葡萄糖102.17 g/L、K2HPO4 82.27 g/L,柠檬酸钠 1.23 g/L、MgSO4 2.00 g/L、腺嘌呤 4.00 g/L、L-Met 7.00 g/L和二甲苯0.50%,在此条件下,SAM产量达到了 1.67 g/L,比出发菌株提高了 67%。本章以酿酒酵母基因组为模板,PCR技术扩增腺嘌呤磷酸核糖基转移酶合成基因apt1,sam2,并成功构建重组质粒pCB 1004-Pgpd-apt1-Pgpd-sam2。通过PEG-CaCl2法,成功把线性化重组质粒pCB 1004-Pgpd-apt1-Pgpd-sam2导入雅致放射毛霉(Actinomucore legans)ZGB 1原生质体中,通过后期的产量筛选与抗性验证,获得了 SAM高产工程菌株。在使用优化合成体系中,其SAM产量达到1.63 g/L,比出发菌株ZGB1的0.59 g/L提高了 1.76倍。
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