Sclerotium rolfsii(Athelia rolfsii)是一种植物致病性担子菌,是工业生产硬葡聚糖的重要菌种。由于缺乏遗传工具,S.rolfsii进一步的分子生物学研究无法开展。在已有报道中,预测的S.rolfsii生物合成硬葡聚糖共有五个步骤,其中前三个步骤是真菌生物合成胞外多糖的通用步骤,而剩下两个步骤为硬葡聚糖生物合成特有步骤,但目前参与此特有步骤的关键基因和催化反应的酶等尚未被鉴定,合成通路与转录调控机制仍不清楚,这极大地限制了其高效生产,影响了其在工业、食品和环境修复等方面的广泛应用。本论文以齐整小核菌(S.rolfsii)为研究对象,前期实验通过产糖转录组测序和RT-qPCR分析,得到了六个可能参与特有产糖步骤的功能基因。为了进一步研究这些基因的功能,建立了根癌农杆菌介导的S.rolfsii转化系统,以实现对该菌种的遗传操作。利用同源过表达技术上调候选基因表达水平,同时利用RNAi技术使候选基因的表达水平下调,在发酵条件下观察候选基因表达水平对硬葡聚糖产量的影响,验证硬葡聚糖合成途径中第四步和第五步的关键基因。最后对筛选到的关键基因在酿酒酵母中进行异源表达、纯化与体外酶活检测,以确认该基因是否具有对应步骤的催化酶活和功能。主要工作和结果如下:第一,预测并分析了六个候选基因的蛋白结构,构建了候选基因编码蛋白的系统发生树。结果表明所有筛选基因的编码蛋白都具有糖类蛋白家族的功能团,大多候选基因与糖类合成酶等功能酶类亲缘关系较近,此预测结果给后续实验研究提供了理论支持。第二,成功构建了根癌农杆菌介导的S.rolfsii遗传转化体系。利用根癌农杆菌LBA 4404菌株,成功地转化了S.rolfsii并表达了在内源GPD启动子控制下的三个报告基因(红色荧光蛋白DsRed和tdTomato,β-葡萄糖苷酸酶基因GUS)和一个basta抗性基因bar。我们发现在齐整小核菌转基因表达中内含子不是必需的,而且红色荧光蛋白DsRed和tdTomato表达持续时间较短,但GUS基因可较长时间存在。此遗传转化系统为后续的基因功能研究提供了技术支撑。第三,分别对六个候选基因进行了同源过表达和RNAi,在相同发酵培养条件下,我们发现第五步骤中基因GME1658表达水平下调时,产糖量发生了肉眼可见的下降,与野生型菌株相比RNAi1658(1658down)菌株产糖量至少下降了40%,菌株OE1658(1658up)产糖量至少是野生型菌株产糖量的2倍。RT-qPCR的结果表明,RNAi1658菌株的GME1658表达量至少是野生型菌株的1/12,过表达菌株中GME1658表达量至少是野生型菌株的30倍。此外,我们发现第四步中基因GME4934也产生了与上述类似的表型,当GME4934表达水平下调时,产糖量发生了肉眼可见的下降,与野生型菌株相比RNAi4934(4934down)菌株产糖量至少下降了42%,菌株OE4934(4934up)产糖量比野生型菌株至少增加了66%。RT-qPCR的结果表明,RNAi4934菌株的GME4934表达量比野生型至少下降了80%,过表达菌株中GME4934表达量至少是野生型表达量的1.6倍。第四,构建了酿酒酵母异源表达GME1658和GME4934的菌株以及单独表达GME1658和GME4934的菌株,为后续研究体外酶活和关键调控因子等工作提供了基础。综上,我们成功构建了根癌农杆菌介导的齐整小核菌遗传转化系统和RNAi与过表达基因操作系统,并利用此筛选到了两个未见报道的参与硬葡聚糖生物合成的关键基因,将进一步利用酿酒酵母表达系统证实了这两个蛋白的体外催化活性。本论文的研究将有助于推进S.rolfsii生物合成硬葡聚糖通路和分子调控机制的研究,并为基因工程改造等技术提供理论依据和支持。