翻译调控肿瘤蛋白(TCTP)是一种高度保守的蛋白,广泛存在于动植物细胞中,且在肿瘤细胞中高量表达。TCTP蛋白最早是在人乳腺癌细胞、小鼠肉瘤细胞中被发现的。随着对TCTP的不断研究,研究者发现,TCTP参与机体众多的生物学过程,例如,它能够调控细胞周期、调节蛋白质的合成、调节免疫反应、参与抗凋亡活性等多项生命活动,可见其在生物体的生长发育过程中发挥着十分重要的作用。长期以来,研究者对TCTP的研究从未停止,其作用机理也更加明确。蛋白质作为生命活动的重要物质基础,受多种因素的影响。类泛素化修饰作为一个重要的因素,能够通过影响蛋白定位、蛋白稳定性和蛋白的折叠来调控蛋白的功能。类泛素化修饰是研究者在研究泛素修饰时发现的一种特殊的修饰方式,它通过与泛素化类似的作用方式,将类泛素蛋白通过特定的赖氨酸连接到目的蛋白上发挥作用,类泛素蛋白修饰物主要包括SUMO、NEDD8、ISG15、FUB1等。近年来,随着科学技术的不断进步,研究者对类泛素化修饰的了解也进一步加深,研究表明其不仅能影响蛋白的功能,还会引起机体的重大疾病。因此,类泛素化修饰在蛋白中的作用机制得到研究者的广泛关注。家蚕是重要的经济昆虫,被认为是研究遗传学和免疫学良好的模式生物,同时养蚕业多年来受到核型多角体病毒(BmNPV)的威胁,给养殖业造成严重的经济损失,研究新型抗病毒家蚕素材刻不容缓。TCTP是生物体内重要的免疫蛋白,它的功能受到多种修饰的调控。基于对TCTP功能的认识,本研究主要探讨家蚕TCTP发生类泛素化SUMOylation修饰的关键位点,并且研究SUMOylation修饰是否以及如何影响BmTCTP的免疫功能。通过研究得到了以下结果:1.家蚕TCTP类泛素修饰位点的鉴定及其功能分析为了寻找BmTCTP发生SUMOylation修饰的关键赖氨酸位点,我们通过Co-IP实验证明,BmTCTP第164位的赖氨酸是重要的类泛素化修饰位点。随后,我们分别构建了稳定表达FLAG-BmTCTP-WT和FLAG-Bm TCTP-K164R的细胞系,通过免疫共沉淀技术富集了这些蛋白,并采用质谱技术鉴定了与其相互作用的蛋白,最终鉴定到与BmTCTP-WT特异结合的蛋白有207种。通过Go功能分析,我们发现这些蛋白主要参与家蚕蛋白磷酸酶调控、蛋白转运、免疫应答和蛋白定位等生物学过程。为了验证BmTCTP的免疫功能,我们将BmN细胞内源BmTCTP干涉后,侵染核型多角体病毒(BmNPV),72 h后,检测Bm NPV的复制量,结果显示,随着BmTCTP表达量的降低,BmNPV的复制量不断上升,说明BmTCTP在抑制BmNPV复制过程中起重要的作用。2.家蚕TCTP类泛素化修饰对其功能的影响首先,我们通过亚细胞定位分析发现,BmSmt3-TCTP(Bm Smt3是家蚕SUMOylation修饰的底物蛋白,BmSmt3-TCTP是将BmSmt3和BmTCTP融合表达)、BmTCTP-WT和BmTCTP-K164R的定位一致,都主要存在于细胞质中。在侵染BmNPV后,大量的BmSmt3-TCTP和BmTCTP-WT蛋白进入细胞核中响应免疫应答,并且,BmTCTP-WT在核质中均存在明显的SUMOylation修饰,而BmTCTP-K164R仅有少量蛋白入核,在核质中的SUMOylation修饰明显减弱。以上结果表明,在侵染病毒后,SUMOylation修饰能够促进BmTCTP的入核。随后,我们干涉BmN细胞内源的BmTCTP,转染相同量的Bm Smt3-TCTP、BmTCTP-WT和BmTCTP-K164R质粒,BmNPV侵染72 h后,检测BmNPV的复制量,结果显示,BmSmt3-TCTP、Bm TCTP-WT和BmTCTP-K164R对BmNPV的抑制效果依次减弱,该结果表明BmTCTP的SUMOylation修饰能够增强Bm TCTP的免疫功能。UBC9作为泛素结合酶,在SUMOylation修饰过程中起重要的催化作用。我们分别将BmN细胞中的BmUBC9蛋白表达量上调和下调后,侵染BmNPV,同时检测BmTCTP的表达量,结果显示,BmUBC9能显著抑制BmTCTP表达量的下调。随后,我们在蛋白水平检测侵染BmNPV后,BmUBC9对Bm TCTP的SUMOylation修饰的影响,结果显示,在侵染BmNPV后,BmUBC9能有效地增强BmTCTP的SUMOylation修饰,并且该修饰呈现先上升后下降的趋势。以上结果表明,SUMOylation修饰能增强BmTCTP的免疫功能,BmUBC9在BmTCTP发挥免疫功能时起重要的催化作用。3.家蚕TCTP与白细胞介素增强因子调控关系为了对Bm TCTP的免疫功能有更深入的了解,我们在质谱鉴定到与BmTCTP特异相互作用的蛋白中,发现了可能参与家蚕免疫反应的白细胞介素增强因子(BmILF)。接下来,我们进一步研究了BmILF与Bm TCTP之间的调控关系。首先,在家蚕BmN细胞中过表达BmILF蛋白,随后,BmNPV侵染72 h,检测BmNPV复制量,结果显示,BmILF可以有效地抑制BmNPV的复制。同时,我们通过Co-IP和细胞共定位实验推测,正常情况下,细胞中BmTCTP与BmILF发生较弱的蛋白相互作用,而在侵染病毒后,BmTCTP可以入核并与BmILF发生相互作用。进一步,我们发现过量表达BmTCTP能够上调BmILF的表达,并且在侵染BmNPV后,BmTCTP可以显著提高BmILF的表达量。以上实验表明,BmTCTP可以通过基因水平调节Bm ILF的表达来参与免疫反应。综上研究,我们总结家蚕BmN细胞在侵染BmNPV后,BmSmt3/BmUBC9介导Bm TCTP发生SUMOylation修饰,并且调控下游基因BmILF的表达来响应免疫应答。当家蚕细胞感染BmNPV后,大量BmTCTP进入细胞核中抑制BmNPV的复制,此时,BmUBC9催化核内的BmTCTP发生SUMOylation修饰以维持该蛋白的稳定性,进一步,BmTCTP刺激下游基因BmILF的表达,而BmILF再通过调控其他免疫蛋白来共同抑制BmNPV的复制。