植物病害严重影响作物的品质和产量,威胁世界粮食安全。水稻作为世界最重要的粮食作物之一,建立高效的功能基因组学研究方法,获得丰富的遗传资源,对于深入了解水稻抗病分子机制,加速水稻抗病育种具有重大意义。近年来,CRISPR-Cas9基因组编辑技术的出现为生命科学研究带来了前所未有的变革。随着该领域的迅速发展,除了使用最为广泛的CRISPR-Cas9之外,新的CRISPR系统被不断发现,尤其是CRISPR-Cas12a,极大拓展了基因组编辑的范围。此外,基于CRISPR-Cas系统的各种遗传操作工具也被开发出来,使CRISPR系统的应用不再局限于基因编辑,还可以进行转录调控、表观修饰、碱基编辑等。本研究旨在建立并优化多种适用于植物的CRISPR技术,加速水稻抗病相关基因的鉴定。为此,我们在水稻中建立了CRISPR转录激活系统以及基于Cas12a的多位点编辑系统。此外,我们还开发出了一种全新的阵列式CRISPR文库构建方法,并基于该方法构建了靶向水稻全部类受体激酶（receptor-like kinases,RLKs）的CRISPR突变体库。本研究的主要结果如下。第一,构建并比较了基于dCas9的不同载体系统的转录激活效率。本研究建立了三种不同的转录激活载体系统,包括在d Cas9上融合转录激活结构域VP160的d Cas9-VP160系统、d Cas9融合SNAC1转录激活结构域（SNAC1 activation domain,SA）的d Cas9-SA系统以及基于d Cas9-MCP-VP160的协同激活系统。通过在水稻原生质体中的比较,d Ca9-VP160表现出最高的激活效率,可将目标基因的表达提高22.8倍。随后,利用内含子表达t RNA-g RNA（intronic polycistronic t RNA-g RNA,in PTG）的策略,进一步优化了d Cas9-VP160转录激活载体,构建单个PolⅡ启动子同时表达sg RNA和d Cas9-VP160的融合基因结构。内含子表达sg RNA的in PTG-d Cas9-VP160系统比常规的Os U3p表达sg RNA的转录激活效率提高了2.3～4.1倍。第二,建立适用于水稻的FnCas12a以及Lb Cas12a高效多位点编辑系统。本研究建立了四种基于Cas12a的多位点编辑载体系统,包括利用Os U3p表达cr RNA的p32Fn和p32Lb,以及内含子表达cr RNA的p33Fn和p33Lb。结合这些载体,我们还设计了利用cr RNA array和PTC（Polycistronic t RNA-cr RNA）同时表达多个cr RNAs的策略实现多位点的编辑。通过在水稻原生质体以及转基因植株中对比不同系统的效率,结果表明,所有系统都能在水稻中实现多位点的编辑,其中Os U3p::cr RNA array-UBI10p::Fn Cas12a表现出最高的多基因编辑效率以及靶片段删除的效率。此外,本研究对比了目前水稻中已建立的基因组编辑系统的效率,包括CRISPR-Cas9、Fn Cas12a、Lb Cas12a以及Cas9-NG。结果表明,CRISPR-Cas9表现出远高于其他的基因编辑效率（92.6%）和双等位基因突变效率（85.1%）,因此,选择CRISPR-Cas9用于构建高通量遗传筛选体系。第三,设计了FLASH基因编辑流水线用于CRISPR文库构建。利用CRISPR进行遗传筛选时往往需要大量的突变植株,过去常采用构建混合型CRISPR文库（pooled CRISPR library）的方式来实现,而该方法需要繁琐的测序来确定每个植株的sg RNA,花费也较多。因此,本研究开发了一种新的阵列式CRISPR文库（arrayed CRISPR library）构建方法,即通过PCR检测不同长度的片段来代替sg RNA鉴定的FLASH（Using PCR fragment-length-tag to proxy sg RNA distinguishing）CRISPR文库构建方法。在FLASH基因编辑流水线中,我们构建了一套12个包含不同长度DNA片段作为标签（FLASH标签）的CRISPR-Cas9载体。当把sg RNA组装到这些载体中后,每组12个载体中的每个sg RNA即与特定的FLASH标签偶联在一起。这样的一组12个载体即可混合转化获得基因编辑植株。由于sg RNA与FLASH标签的偶联关系,利用PCR和常规的凝胶电泳即可简单快速的鉴定出由FLASH标签所代表的sg RNA,进而获得所突变靶基因的信息。利用该方法可以快速构建阵列式CRISPR文库用于不同规模的植物基因编辑。第四,利用FLASH基因编辑流水线,构建了靶向水稻全部1072个RLK基因的阵列式CRISPR文库。以12个Cas9/sg RNA载体为一组,我们将靶向RLK的sg RNA分别克隆到携带FLASH标签的Cas9载体中,全部载体共分为89个转化小组,一次性转化获得5039个T0代转基因株系。通过检测FLASH标签的方法,快速且准确地完成全部植株sg RNA的鉴定。根据检测结果,RLK突变体库覆盖了89%（955/1072）的靶基因,其中74.3%（710/955）的基因有≥3个独立的T0株系。RLK突变体库具有极高的突变效率,在391个随机检测的靶基因中,有92.1%（360/391）发生了编辑,说明FLASH标签也紧密关联了靶基因突变。此外,FLASH基因编辑流水线还允许我们对发生频率较低的T-DNA瞬时表达的意外编辑事件进行追踪。RLK突变体库可用于水稻抗病相关基因的快速筛选,利用稻瘟病菌M.oryzae离体接种,我们从14个候选基因中初步筛选到8个正调控水稻抗病的RLK基因。综上所述,本研究首先优化并比较了用于植物基因组编辑和转录激活的CRISPR-Cas系统。根据比较结果,选择最为高效的CRISPR-Cas9系统,建立了用于水稻阵列式文库筛选的FLASH基因编辑流水线。实践表明,该方法以其高效、灵活等优势能够快速构建各种规模的阵列式CRISPR文库,促使CRISPR筛选成为植物研究的常规方法。本研究所建立的多种CRISPR遗传操作技术以及丰富的RLK突变体资源必将加快作物遗传育种和功能基因组学的发展。