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背景肝细胞癌( Hepatocellular carcinoma, HCC )死亡率在全球癌症死亡率中居第三位,在我国为第二位癌症死因。采取以手术治疗为主的综合治疗方式,虽有效提高了术后生存率,但即使根治性切除,术后复发率1年达20%-64%;3年高达57%-81%,而局部治疗的转移复发率更高。转移复发已成为进一步提高肝癌生存率的一个瓶颈。肝癌细胞的转移有三个途径,首先是肝内转移,第二是肝外转移,第三为种植转移。通过对肝癌早期转移机制研究发现肝癌细胞多通过门静脉发生肝内转移,肝癌细胞与门静脉内皮细胞的粘附是形成肝癌肝内转移的关键所在。α-1,3岩藻糖转移酶( alpha -1,3 fucosyltransferase , FUT )是一类催化岩藻化寡糖合成的酶类[1]。参与唾液酸化路易斯抗原(Sialyl Lewis X, SLeX)合成最后一步的岩藻糖化反应,有9个亚型[2]。其中α-1,3岩藻糖转移酶Ⅳ(FUT4)是SleX合成的关键酶[3]。SLeX是最常表达在胚胎组织及肿瘤细胞表面糖脂和糖蛋白上的含有寡聚糖的一组碳水化合物抗原[4, 5]。它不仅是三种选择素(E,L,P-选择素)最小可识别的配体,而且是肿瘤相关的糖链抗原[6]。经研究发现SleX抗原强表达于有关的肿瘤细胞表面如结肠癌、胃癌、肝癌等细胞,且SleX的表达水平与肿瘤的转移能力,手术后复发密切相关[6, 7]。我们前期病理研究[8]也已证实在原发灶肝癌细胞SleX表达阳性率为64.10%,并且存在门脉癌栓、有术前肝外转移、有卫星灶、术后3月内复发患者sLeX表达有更高的阳性率。基于这一特点,有研究通过单克隆抗体封闭SleX和内皮细胞选择素(endothelium-selectin, E-selectin)的粘附来阻断肿瘤细胞转移,获得良好效果[9],另一些研究则通过模拟聚合物的方式来抑制这两者结合也取得了一定的效果[10],但是都有一定的缺点及应用局限性。因此总结前人经验和我们大量前期实验基础上,考虑对肝癌HepG2细胞采用RNA干扰的方法。通过微小干扰RNA( micro-RNA, miRNA )沉默α-1,3岩藻糖转移酶基因,降低肝癌细胞表面SleX配体的表达,从而达到与E-selectin的相互粘附作用减弱,阻断肝癌细胞粘附转移的途径。而该实验成功的必要条件是构建高效合适的miRNA干扰载体:从FUT4-mRNA中依据miRNA设计原则找出四个最优的干扰靶位点,把每个位点序列单独嵌合在载体上形成miRNA干扰载体,随后载体扩增和转染细胞,并通过一系列的实验手段分析比较四个miRNA干扰载体干扰效果,选取最好的干扰载体进行下一步的稳定转染,为后续实验奠定基础。目的:1、探讨α-1,3岩藻糖转移酶Ⅳ基因miRNA干扰对肝癌细胞转移的意义。2、构建表达α-1,3岩藻糖转移酶Ⅳ基因miRNA序列的载体。3、鉴定α-1,3岩藻糖转移酶Ⅳ基因miRNA序列的沉默效果,筛选出高效的干扰片段及载体。方法:软件Cenix bioscience设计合成针对FUT4-mRNA的FUT4-miRNA四个候选干扰片段。并逐个与pcDNA?6.2-GW/EmGFPmi载体退火连接形成FUT4-miRNA干扰载体;转化单克隆扩增后测序;转染人肝癌HepG2细胞,进行荧光显微镜观察,荧光定量PCR ( FQ-PCR )检测FUT4-mRNA在不同组别的表达情况,并比较选出沉默效率最好的一组。western-blot在蛋白质水平检测FUT4蛋白量。实验分为转染组,阴性对照组及空白组。结果:测序结果证实载体包含有靶基因的miRNA序列,并正确连接,DNA电泳显示质粒纯度高,无其他DNA杂质。荧光定量PCR结果说明实验组FUT4-mRNA比空白对照组少(P<0.05),阴性对照组和空白对照组没有明显差别(P>0.05)。同时western-blot结果显示实验组FUT4蛋白表达量和空白对照组比明显降低(P>0.05)。结论:1、BLAST分析四组miRNA序列片段与人类原癌基因无同源性,阴性对照序列片段与目的基因无同源性。2、四组miRNA序列片段和阴性对照序列片段完整,正确连接至载体。3、质粒成功转染人肝癌HepG2细胞,无内毒素,核酸毒性较低,转染效率40%。4、质粒在人肝癌HepG2细胞存在转录翻译。5、059-1组质粒及其包含的干扰片段沉默效率最高,达到44%-53%