背景与目的:骨髓炎（Osteomyelitis,OM）是由细菌、真菌或分枝杆菌等化脓性生物感染引起的骨内炎症过程。这是儿科人群中常见的问题,据统计,2014年全球儿童骨髓炎发病率在大约5-8/10000,在发展中国家尤其是非洲,儿童慢性血源性骨髓炎的发病率为21.6%。儿童期以急性、亚急性血源性骨髓炎常见,多篇文献报道85%的病例发生在17岁以下的儿童。骨髓炎的主要病因可能是血源性的、来自邻近感染灶的追踪、以及来自创伤或手术的直接接种。当症状持续时间小于2周时,即为急性过程。急性血行性骨髓炎常累及儿童骨骼,生长长骨骺端血管丰富,内皮渗漏,血流缓慢,常为感染的主要部位。延迟诊断和不恰当的治疗可能会导致败血症、强烈的炎症反应,破坏骨结构,导致纵向生长停滞或骨缺损,甚至导致多器官功能衰竭和死亡的恶化结果。金黄色葡萄球菌（S.aureus）感染是骨髓炎最常见的致病菌,它通过毒力因子的分泌和对其结构成分的识别,可引起强烈的炎症反应,导致骨髓炎期间大量骨丢失。外周血单核细胞（PBMCs）是树突状细胞、破骨细胞和巨噬细胞的前体,是募集的关键分子,对金黄色葡萄球菌感染具有即时和有效的免疫反应,在炎症性骨丢失中发挥重要作用。受到抑制的单核/巨噬细胞可能会增加对金黄色葡萄球菌感染的易感性,而炎症性单核/巨噬细胞的早期积累可能成为细胞内金黄色葡萄球菌存活的宿主,从而促进细菌对抗生素治疗的耐药性。然而,巨噬细胞在金葡菌诱导的骨内感染急性期的迁移和免疫反应机制尚不清楚。明确巨噬细胞迁移对金黄色葡萄球菌感染的反应对于确定治疗金黄色葡萄球菌感染引起的骨髓炎的靶点至关重要。TWIST 1（twist family bHLH transcription factor 1）,该基因编码一种基本的螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子,在胚胎发育中起重要作用。编码的蛋白形成同型二聚体和异型二聚体,它们与DNA E-box序列结合,并在颅骨发育过程中调节涉及颅缝闭合的基因转录。该蛋白还可能调节神经管闭合、肢体发育和褐色脂肪代谢。该基因在多种人类癌症中高甲基化和过表达,编码的蛋白促进肿瘤细胞的侵袭和转移。我们通过对芯片GSE16129进行生物信息学分析得出:TWIST1在单核细胞中高表达,且与骨矿化调节有关,通过制造内植物相关的金葡菌性骨髓炎模型,我们证实感染后TWIST1在髓腔内巨噬细胞中高表达,本研究主要从动物模型、细胞实验、细菌实验三个方面阐述TWIST1在巨噬细胞中高表达及促进巨噬细胞向病灶迁移和增强其吞噬功能的分子机制。材料和方法:1.从GEO公共数据库下载GSE16129芯片数据库数据,基于三个平台（GPL96、GPL97和GPL6106）,进行了生物信息学分析。由于在GPL6106平台上只有一例金黄色葡萄球菌感染的骨髓炎样本,我们没有将其纳入本研究。通过生物信息学方法得到与骨髓炎相关的差异基因（OMRGs）。2.利用 DAVID 数据库（http://david.abcc.ncifcrf.gov）对 OMRGs 进行 GO 功能注释和KEGG通路富集分析。3.利用STRING数据库对OMRGs中相互作用的蛋白进行分析,并且利用Cytoscape 软件的 MCODE 插件,通过设置阈值为 degree cutoff=2,node score cutoff=0.2,k-core>=2,max.depth=100,对相互作用蛋白网络进行模块化分析。4.金葡菌从南方医院骨髓炎患者分离并鉴定后进行培养、定量、稀释后备用。5.8周大小C57BL/6小鼠用来建造骨髓炎模型,我们通过在右侧股骨髓内放置2mm不锈钢髓内针（粗0.3mm）并且向髓内注射2微升1×106 CFU/ml金葡菌稀释液来制造感染模型,培养三天后取材进行下一步实验。动物实验操作都是严格按照南方医院动物手术的指导方针和政策进行。6.免疫组化检测内植物相关的骨髓炎模型的石蜡切片标本中髓腔内巨噬细胞聚集情况和TWIST1在感染后的组织中表达情况。7.免疫荧光共定位用来检测在骨髓炎模型的冰冻切片标本中感染灶周围的巨噬细胞中TWIST1的表达情况。8.利用瞬时转染技术,转染TWIST1的特异小干扰RNA（si-RNAs）,在基因水平上下调TWIST1。9.利用RT-Q-PCR技术检测（1）不同浓度金葡菌与Raw264.7小鼠巨噬细胞系细胞共培养1小时,庆大霉素杀灭胞外细菌后再次培养24小时后检测TWIST1,NANOG,ERBB2的水平变化,和Raw264.7巨噬细胞死亡率以及这三个基因的mRNA和蛋白水平改变,从而得到最适宜感染MOI（感染细菌丰度和Raw264.7数目比值）。（2）金葡菌与Raw264.7细胞共培养1小时后杀灭胞外细菌后检测与巨噬细胞极化相关的基因。（3）用于检测小干扰RNA（siRNAs）干扰TWIST1后的干扰效率。10.利用Western-blot检测（1）内植物相关的金葡菌性骨髓炎小鼠模型的股骨髓腔中目标基因TWIST1蛋白水平改变。（2）金葡菌感染Raw264.7细胞后TWIST1,MMP9,MMP13,p-NF-K B（p-P65）,NF-κB（P65）水平改变。（3）利用 p-NF-κB特异抑制剂BAY11-7082（BAY）下调p-P65后TWIST1,MMP9,MMP13蛋白水平改变。（4）在感染条件下利用小干扰RNA（siRNAs）干扰TWIST1后MMP9,MMP13蛋白水平改变。11.利用划痕实验和Transwells实验检测金葡菌对于Raw264.7巨噬细胞迁移情况的影响,以及下调TWIST1后的迁移情况。12.利用细胞吞噬细菌、杀灭细菌实验以及细菌涂板培养、菌落计数明确下调TWIST1后Raw264.7细胞吞噬金葡菌的能力情况。结果:1.从GSE16129芯片分析与骨髓炎相关的差异基因（OMRGs）。在GEO数据库下载GSE16129芯片,在GPL96平台下得到57个与骨髓炎相关的差异基因（OMRGs）其中29个上调的OMRGs和28个下调的OMRGs,在GPL97平台下得到25个与骨髓炎相关的差异基因（OMRGs）,其中21是上调的OMRGs,4个下调的OMRGs。2.利用GO功能富集、KEGG pathway和PPI蛋白互作网络数据库对OMRGs生物学功能进行富集。从GO富集数据库得到上述82个OMRGs主要富集在与RNA聚合酶Ⅱ启子的转录正调控、骨矿化、免疫应答等方面,其中骨矿化处富集的基因为S1PR1、TWIST1和phosphphol。KEGG pathways方面主要富集在天然杀伤细胞介导的细胞毒性和抗原的加工提呈,特别是与抗原加工提呈相关的途径。PPI蛋白互作网络得到TWIST1、NANOG和ERBB2这三个基因处于蛋白相互作用网络中心。综合GO富集、KEGG pathway富集和PPI蛋白互作网络得出TWIST1可能骨髓炎模型中的单核/巨噬系统发挥重要作用。3.TWIST1在感染灶周围的巨噬细胞中高表达。通过RT-Q-PCR、Western Bolt检测TWIST1在感染后髓腔内mRNA和蛋白水平高表达,通过组织免疫组化发现TWIST1在感染灶周围高表达;通过免疫荧光共定位得到TWIST1在感染灶周围的巨噬细胞中高表达。4.TWIST1可能与感染金葡菌后巨噬细胞的极化相关。同RT-Q-PCR检测与巨噬细胞相关的极化标志物,发现在感染条件下,下调TWIST1后巨噬细胞极化也会发生改变。5.TWIST1可能参与调控巨噬细胞迁移能力和对金葡菌的吞噬和杀灭功能。在金葡菌感染条件下,通过划痕实验和Transwell实验发现Raw264.7巨噬细胞系迁移能力上调,然而下调TWIST1后其迁移能力下降。并且下调TWIST1后Raw264.7巨噬细胞系吞噬和杀灭金葡菌的能力也随之下降。6.金葡菌可能通过P65/TWIST1/MMP9/MMP13轴调控巨噬细胞迁移。我们利用P65特异抑制剂BAY11-7082（BAY）预先处理Raw264.7巨噬细胞系后与金葡菌共培养,通过Western Blot发现TWIST1、MMP9和MMP13相对于对照组下调;并且在金葡菌感染条件下,下调TWIST1后,我们发现MMP9和MMP13也下调。结论:TWIST1在金葡菌诱发的骨髓炎疾病模型的感染灶周围的巨噬细胞中高表达,并且TWIST1可以参与调控巨噬细胞的迁移、吞噬以及杀灭金葡菌和巨噬细胞极化等生理病理过程,并且我们发现金葡菌可以通过P65/TWIST1/MMP9/MMP13轴调控巨噬细胞迁移。