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环鸟苷酸（guanosine-3’,5’-cyclic monophosphate,c GMP）作为第二信使在真核生物中发挥重要作用。动物中c GMP依赖性蛋白激酶（c GMP-dependent protein kinase,PKG）通过接受由一氧化氮（nitric oxide,NO）促发形成的c GMP信号而被激活,并广泛参与各种生物学过程。NO-c GMP-PKG信号通路在调控哺乳动物包括人类的心血管舒张、神经递质传递等方面具有重要作用。植物中c GMP参与了生长发育、激素信号转导及逆境响应等诸多过程。一些药理学和生化数据预示植物可能存在介导c GMP的PKG同源蛋白。然而,植物是否存在PKG仍然缺乏直接的证据。本研究从进化、分子、遗传、生化、细胞及生理等方面从植物中鉴定并阐明了PKG的作用及其介导的信号通路。主要结果如下:1.为探索植物界是否存在PKG,本研究首先搜索不同植物种类包括水稻和拟南芥基因组数据库,结果发现PKG普遍存在于不同植物种类中,结构域分析发现植物PKG除含有动物PKG保守的功能域CNBD-CNBD-PKinase外,其N端区域还具有一个独特的PP2C催化域。系统进化分析表明植物PKG起源自单细胞藻类,其PP2C功能域起源于外显子重排或PP2C基因融合,从而进化成为PP2C-CNBD-CNBD-PKinase的独特结构,且是植物界唯一类型的PKG。2.为分析植物PKG基因是否编码PKG蛋白及其生化特性,本研究从水稻中克隆PKG全长编码序列（CDS）及其截短片段,在大肠杆菌中表达PKG全长及各种截短蛋白进行生化分析。结果发现水稻PKG具有蛋白激酶和蛋白磷酸酶的双重活性,其激酶活性依赖于c GMP,而其磷酸酶活性则不依赖于c GMP且受c GMP抑制。等温滴定微量热分析表明水稻PKG中CNBD-A结构域直接结合环核苷酸分子,且对c GMP亲和力显著高于c AMP,而CNBD-B则发生退化失去结合环核苷酸能力。这些结果表明水稻PKG通过其CNBD-A结构域直接结合并响应c GMP信号分子而调节其蛋白激酶活性,具有c GMP依赖性蛋白激酶的生化特性。同时,植物PKG独具的磷酸酶活性不依赖于c GMP且受c GMP抑制。3.水稻PKG在茎、根分生区、根中柱、叶片、发育中的颖花、花粉粒及萌芽中的种子等生长活跃组织的表达量较高,预示其在生长发育中的作用。通过分离鉴定水稻PKG缺失突变体pkg-1和pkg-2,结果发现pkg缺失突变体植株半矮化、花粉育性降低、GA诱导的种子萌发受阻,种子产量比野生型降低36%-42%。这些结果显示PKG在调控水稻植株生长、花粉育性、种子萌芽及种子产量等方面具有重要作用。4.PKG缺失突变体pkg表型预示PKG参与赤霉素（gibberellic acid,GA）信号,为探索植物PKG是否及如何介导GA信号,本研究以萌发种子为材料,通过分析野生型和pkg突变体萌发种子对响应GA信号过程,结果发现GA可促发NO和c GMP的形成,并且NO介于GA与c GMP之间,同时,NO、GA和c GMP均可促进淀粉酶的诱导及种子萌芽,且这种效应依赖于PKG,表明PKG介导GA信号且经由GA-NO-c GMP-PKG信号级联途径。5.为探索PKG如何将GA信号传递至下游实施其生理效应,本研究通过酵母双杂交文库筛选鉴定到若干PKG互作蛋白,其中包括涉及GA信号的转录因子GAMYB;亚细胞定位分析表明PKG与c GMP共定位胞质中,而GAMYB定位胞质和细胞核中。通过双分子荧光互补实验（Bi FC）分析表明PKG-GAMYB互作发生在细胞质。体外激酶活性表明PKG可磷酸化GAMYB,其激酶活性存在c GMP剂量依赖效应,点突变实验表明其磷酸化位点为GAMYB Ser6。相反地,PKG的PP2C功能域则可催化GAMYB（p Ser6）的去磷酸化。这些结果表明PKG结合于GAMYB并对GAMYB Ser6进行可逆磷酸化,其激酶催化GAMYB Ser6的磷酸化,而其PP2C磷酸酶对GAMYB（p Ser6）进行去磷酸化。6.凝胶迁移实验（EMSA）表明PKG对GAMYB的磷酸化不影响其与靶基因启动子DNA的结合能力。观察亚细胞定位表明PKG为GAMYB核转运所必需,PKG缺失导致GAMYB滞留于胞质中,并且PKG介导了GA、NO和c GMP对GAMYB核转运的促进作用。PKG的激酶功能域促进GAMYB的核定位,而其PP2C功能域则阻遏GAMYB的核转运过程。进一步分析表明PKG对GAMYB Ser6磷酸化是GAMYB入核所必需的。这些结果表明PKG响应GA信号并通过其激酶、磷酸酶活性双向调节GAMYB Ser6可逆磷酸化过程,从而精确调控GAMYB的核质分布。7.为进一步分析PKG与GAMYB互作及其对GAMYB磷酸化在植株体内的效应,本研究分离鉴定了gamyb突变体,结果发现gamyb与pkg突变体表型类似。GA响应基因RAmy1A和RAmy3E表达和淀粉酶的诱导在gamyb与pkg突变体种子对GA、NO和c GMP信号响应均受阻,并且pkg突变体阻断了GAMYB超表达对植株生长和淀粉酶诱导的促进作用,说明GAMYB的功能依赖于PKG。这些结果表明PKG与GAMYB互作并作用于同一信号通路响应GA调控植株生长、花粉发育和种子萌发过程。8.此外,本研究还发现PKG缺失增强了愈伤组织中类黄酮的积累及类黄酮合成关键基因表达量的上调。在烟草异源表达PKG及GAMYB发生超敏反应。互作蛋白的筛选表明PKG可与多种蛋白产生互作,并且RNA-Seq数据表明PKG广泛参与转录组调控过程,PKG介导的差异表达基因涉及高渗胁迫、生物逆境、离子稳态及细胞壁合成等过程。这些结果表明植物PKG参与的生物学过程具有广泛性。