三七基因组分析及铁皮石斛基因编辑体系的建立

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在药用植物研究中,现代生物学研究是历史发展的必然。药用植物现代化的含义除了药理研究外还包括对植物本身研究的现代化。研究药用植物的基础生物学、有效成分的生物合成机理,对育种和有效成分生产都有重要科学意义。目前已有很多高新技术和现代方法逐步应用于药用植物现代化研究中,其中,基因组测序和基因编辑技术,是当代生物学发展的最前沿技术。本研究选取云南最具代表性的两种药用植物——三七和铁皮石斛,利用现代最前沿的基因组测序技术和CRISPR/Cas9体系进行了基因组解析和基因编辑,对药用植物现代生物学研究具有非常重要的意义。  三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen,2n=2×=24),俗名田七,是五加科人参属多年生草本植物,据古代中医药典记载,三七具有散瘀止血,改善血液循环等功效。经过数十年的药理学研究,三七特有的多种次级代谢产物(人参皂苷和三七皂苷)已经被成功分离、鉴定、并已赋予药用价值。这些研究成果在制药市场得到了广泛应用,通过设计和生产各种口腔和局部用药,可治疗心血管疾病、创伤、软组织疼痛。为了进一步获得三七基因组信息,本研究成功绘制了三七参考基因组图谱,这项研究将成为三七分子育种继EST测序和RNA-seq之后的又一重要成果。本研究采用de novo组装方法,得到了2.39Gb的基因组草图序列,其中contig N50=16kb,scaffold N50=96kb。我们通过CEGMA(coreeukaryotic genes mapping approach)软件对基因组组装完整性进行评价,结果显示80%的超保守基因落在同一条组装的序列上边,96%的超保守基因能够注释出来。我们同时用了BUSCO(benchmarking universal single-copy orthologs)这个软件对三七基因组的组装和注释进行了评价,使用植物共有的保守的单拷贝基因。结果显示82.4%的植物共有的保守的基因可以在组装的基因组中找到,有3.3%的基因在组装的序列中片段存在。此外,为了更好的注释蛋白质编码基因,我们完成了三七转录组测序,并结合基因组数据,分析了12个萜烯合成酶(terpene synthases,TPSs)基因的功能和表达量。总之,我们完成了三七高度重复的复杂基因组测序、组装和注释,探索出了一套适合三七的全基因组辅助选择的现代育种方法,鉴定了有效药用成分生物合成基因及农艺性状控制的关键基因,并且在六个组织器官转录组数据的支撑下,对IPP/DMAPP(异戊烯基二磷酸/二甲丙基二磷酸)生物合成途径和TPS基因进行了基因组学分析。不仅为三七现代生物学研究奠定了良好的基础,同时还为人参属植物的新药研发及成分鉴定提供了丰富的遗传资源。  铁皮石斛(Dendrobium officinale,D.officinale)为兰科多年生附生草本植物,具有独特的观赏价值和广泛的药用功效,种子无需春化作用便可生长,是兰科植物中最具特色的物种之一,被称为“中华九大仙草”之首。铁皮石斛基因组图谱的绘制,使其成为研究兰科植物进化机制、遗传资源解读的模式物种。尽管如此,铁皮石斛现有的遗传学研究方法依然较少,本研究在农杆菌介导的转基因体系基础上,验证了几个新的高效启动子,可用于铁皮石斛基因过表达和CRISPR/Cas9基因敲除体系,也是兰科植物基因编辑体系的主要方法。在我们建立的铁皮石斛转基因体系中,pCambia-1301-35SN载体包含CaMV35S启动子,超绿色荧光蛋白(Superfolder green fluorescence protein,SG)基因和β-glucuronidase(GUS)报告基因,通过农杆菌介导的转基因体系转入植物组织中,当受体植物出现荧光表型可以说明SG基因成果转入植物并且翻译成功能蛋白质。我们将4个新的启动子((MtHP,CVMV,MMV,PCISV))和CaMV35S启动子分别与GUS基因一起整合在相同的载体骨架上,并将两者做对比,结果显示,MMV,CVMV,and PCISV与35S启动子同样有效,说明这4个新的启动子也可用于铁皮石斛转基因体系中。此外,我们在铁皮石斛中成功建立了CRISPR/Cas9基因敲除体系,选择5个木质素合成通路上的关键基因(C3H,C4H,4CL,CCR和IRX),结果显示,每个基因都发生了不同程度的插入、缺失、替换。以上结果表明,本研究建立的2种基因编辑技术体系(基因过表达和基因敲除)可以在铁皮石斛中得到有效应用,不仅可以培育出铁皮石斛新品种,还很好的促进了铁皮石斛现代化研究的进程。
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