cIAP2蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的分子机制研究乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)是一种严重危害人类健康的病原体。已有的研究结果表明病毒和宿主的相互作用决定着病毒感染清除或持续性感染的建立。在HBV感染的清除过程中,机体可通过肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、干扰素-γ(Interferon gamma, IFN-γ)、干扰素-α(Interferon alpha, IFN-α)、干扰素-β(Interferon beta, IFN-β)等细胞因子介导的非杀细胞方式抑制HBV复制,然而这些细胞因子调控的抗病毒基因尚未完全阐明。本室前期通过基因芯片等技术筛选TNF-α诱导的效应基因,发现细胞凋亡抑制蛋白2(cellular inhibitor of apoptosis protein 2, cIAP2)具有抑制HBV复制的效应,但其具体的抗病毒机制尚未完全阐明。本研究首先在pCMV-HBV复制系统中验证cIAP2的抗病毒效应。研究结果显示,cIAP2并不影响HBV前基因组RNA的水平和衣壳蛋白的合成,但cIAP2显著下调了HBV复制中间体DNA的水平。siRNA干扰内源性cIAP2的表达后,转入HBV复制型质粒,检测内源性表达的cIAP2对HBV基因表达和复制的影响。研究结果显示,下调内源性cIAP2的表达可明显增强HBV的复制,而并不影响病毒转录的RNA和合成的衣壳蛋白。上述结果提示cIAP2可能影响了HBV前基因组RNA逆转录成DNA过程中的某个环节。为明确cIAP2抑制HBV的功能区域,构建了cIAP2的不同缺失突变体。将HBV复制型质粒和cIAP2截短突变体共转细胞,检测病毒的基因表达和复制情况。研究结果显示,逐步缺失cIAP2蛋白N-端的三个BIR结构域,cIAP2的抗病毒效应有不同程度的削弱,但当缺失C-端的CARD和RING两个结构域后,cIAP2的抗病毒效应完全消失。已知RING结构域负责cIAP2的E3连接酶活性,进一步发现cIAP2的E3连接酶活性区域点突变(cIAP2*)后,其抑制HBV复制的作用完全消失。上述结果提示cIAP2对HBV复制的抑制作用依赖于其RING结构域的E3连接酶活性。鉴于cIAP2抑制HBV复制与其E3连接酶活性相关,而E3连接酶可以促进蛋白的泛素化降解,推测cIAP2可能通过调控HBV复制关键蛋白的表达来发挥抑制HBV复制的效应。将HBV聚合酶、衣壳蛋白、HBx蛋白等表达质粒与cIAP2或cIAP2*表达质粒共转染细胞,筛查cIAP2是否能够调控HBV复制相关蛋白的表达。研究结果显示,cIAP2能够显著下调HBV聚合酶蛋白的表达水平,而不影响衣壳蛋白和HBx等蛋白的表达。cIAP2的E3连接酶活性突变体(cIAP2*)对聚合酶的表达无下调作用,提示cIAP2的E3连接酶活性对聚合酶的下调是必需的。为明确肝细胞内源性的cIAP2对聚合酶的表达是否具有下调作用,利用干扰RNA抑制内源性cIAP2的表达,再转入聚合酶蛋白表达质粒。结果显示,内源性cIAP2的表达被下调后,聚合酶蛋白的表达水平增强,证明内源性表达的cIAP2仍具有下调HBV聚合酶表达的作用。蛋白的稳态表达水平由蛋白的合成和降解两方面决定。为排除cIAP2对聚合酶的下调是由于聚合酶高水平表达而发生错误折叠所致,本研究通过转染低剂量的质粒以降低聚合酶的表达水平,发现cIAP2对低水平表达的聚合酶仍具有明显的下调作用,对聚合酶蛋白相关伴侣分子Hsp90, Hsp70的表达并无影响,同时聚合酶蛋白的高水平表达未引起细胞未折叠蛋白反应。以上结果提示cIAP2并未影响聚合酶蛋白的合成,而可能是促进了聚合酶的降解。为此,进一步使用CHXchase方法检测聚合酶蛋白的半衰期。结果显示,cIAP2显著加快了聚合酶的降解速率,使聚合酶的半衰期由75分钟左右加快到25分钟左右,而cIAP2的E3连接酶活性缺失突变体(cIAP2*)不能缩短聚合酶蛋白的半衰期,相反可以延长聚合酶蛋白的半衰期。细胞蛋白质的降解主要通过两种途径,溶酶体途径或蛋白酶体途径。为确定cIAP2降解聚合酶蛋白的可能途径,本研究分别引入两种途径的特异性抑制剂,检测其对cIAP2降解聚合酶的逆转作用。结果显示,cIAP2对聚合酶蛋白的降解可以被蛋白酶体抑制剂而非溶酶体抑制剂所逆转,提示cIAP2通过蛋白酶体途径降解聚合酶蛋白。鉴于cIAP2对聚合酶的降解与蛋白酶体活性相关且依赖其E3连接酶活性区域,推测cIAP2可能通过促进聚合酶的泛素化修饰来发挥降解作用。体内泛素化实验显示,cIAP2部分促进了聚合酶蛋白的泛素化修饰。以上结果提示cIAP2促进了聚合酶蛋白的泛素-蛋白酶体途径降解。底物的泛素化修饰依赖底物和酶的相互作用,故推测聚合酶和cIAP2之间可能存在相互作用。体内免疫共沉淀和体外GST pull-down实验发现cIAP2和聚合酶之间存在相互作用,并且cIAP2蛋白N-端的BIR结构域,聚合酶的TP、RT、RH结构域参与了两者的结合。聚合酶蛋白在HBV复制过程中结合前基因组RNA并与核心蛋白共同启动HBV前基因组RNA的包装,然后在核衣壳内合成HBV DNA。已经发现cIAP2参与降解聚合酶蛋白,推测cIAP2可能通过抑制HBV前基因组RNA包装来发挥抑制HBV复制的效应。研究结果显示,cIAP2下调了HBV核衣壳相关RNA的水平,且干扰cIAP2的表达后,HBV核衣壳相关RNA的水平显著增加,而HBV衣壳蛋白单体组装成核衣壳的过程未受影响,提示cIAP2下调聚合酶蛋白的表达后,直接影响了HBV前基因组RNA的包装。总结上述结果,本研究发现cIAP2能够促进聚合酶的泛素-蛋白酶体途径降解,并通过下调HBV前基因组RNA的包装,发挥抑制HBV复制的作用。本研究进一步明确了TNF-α诱导的cIAP2的抗病毒作用及其分子机制,有助于解释TNF-α非杀细胞方式抑制HBV复制的机理。以聚合酶蛋白的泛素-蛋白酶体途径降解为切入点有望为新型抗乙肝药物的开发提供思路。