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研究背景：类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以对称性多关节炎为主要临床表现的慢性全身性自身免疫性疾病,基本病理改变为滑膜炎,以滑膜细胞增殖、炎性细胞浸润、血管翳形成以及软骨和骨的进行性破坏为特征,是一种难治性疾病。雷公藤甲素(triptolide, TP)是从雷公藤中分离出的一种环氧化二萜内酯化合物,被认为是雷公藤主要的抗炎和免疫抑制成分之一。现代研究和临床试验也表明其具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等多种生物活性。与此同时,疾病的发生和发展具有复杂性,所以TP治疗RA的具体作用机制仍然需要我们进一步研究。目的：本研究旨在借助生物信息学技术,并结合体内外实验验证,探讨TP通过TREM-1/DAP12信号通路抗炎的作用,进一步阐释TP治疗RA的分子机制。方法：1.利用Pubchem和NCBI Gene公共数据库分别查找TP的人类靶蛋白和RA人类相关基因；并借助IPA生物网络分析平台构建TP靶蛋白与RA疾病的相互作用网络,进一步分析其相互作用网络的功能及相关的生物学通路,最终预测TP治疗RA的优势生物学通络及关键分子靶点。2.进行体内体外实验验证。(1)体外实验：通过LPS刺激经PMA诱导的U937细胞建立炎症巨噬细胞模型,研究TP通过TREM-1信号通路调控炎性因子如TNF-α, IL-1β, IL-6释放的作用。通过TREM-1 siRNA抑制TREM-1的表达,检测抑制TREM-I的表达后TP是否依然可以降低TNF-α, IL-1β, IL-6等炎症因子的表达。(2)体内实验：通过复制Ⅱ型胶原诱导的大鼠关节炎动物模型,对TP通过于TREM-1信号通路调控炎症反应,进一步达到治疗RA的作用进行动物实验验证。结果1.在Pubchem公共数据库中共检索到TP人类靶蛋白8个,在Gene数据库中共检索到与RA相关的人类基因832个。2.生物信息学分析结果发现：RA疾病信号通路主要涉及细胞免疫、体液免疫、细胞因子和第二信使信号四个方面,TP靶蛋白参与的信号通路主要涉及细胞免疫和细胞因子信号,这提示TP靶蛋白与RA人类基因参与的信号通路有重叠。进一步使用生物信息学分析平台的比较分析功能,依据TP参与权重排列,对TP靶蛋白和RA基因共同参与调控的生物学通路比较分析。我们发现TP与RA共同参与的前10条信号通路中,TREM-1信号通路是居于首位的,这提示我们,TP可能是通过TREM-1信号通路来调节炎症反应,进一步达到治疗RA的效果。3.体外实验结果显示：用100ng/mLLPS分别刺激不同时间以后,在实验测定的时间范围内,U937细胞中TREM-1mRNA的表达水平随刺激时间的增加而升高,并且在LPS刺激48 h后TREM-1的表达水平最高；且与LPS组相比,TP能明显降低经PMA诱导和LPS刺激的U937细胞膜上TREM-1的表达,能降低细胞中TREM-1,DAP12 mRNA和蛋白的表达水平,同时能够抑制JAK2和 STAT3的磷酸化表达。与正常组相比,经LPS刺激后,细胞上清中TNF-α, IL-1β, IL-6的表达水平明显升高(P<0.01,P<0.05),而TP则能明显降低TNF-α, IL-1β,IL-6的表达(P<0.01,P<0.05)。4.抑制实验结果显示：用TREM-1siRNA抑制TREM-1后,与正常组相比,细胞中TREM-1的表达有明显下降(P<0.05);与模型组相比,抑制TREM-1后TNF-α, IL-1β, IL-6的表达下降,抑制TREM-1后再用TP作用也可以降低上述细胞因子的表达,但单纯抑制TREM-1组与抑制TREM-1后再用TP作用组之间没有统计学差异。5.关节肿胀及组织形态学结果显示：模型组大鼠的AI评分明显高于正常组(P<0.01),TP和LEF均能明显缓解CIA大鼠的关节肿胀程度。给药的第9天,TH, TL, LEF组的AI值开始低于模型组(P<0.05)。用药15天后,各给药组大鼠关节肿胀程度均明显下降(P<0.01,P<0.05),TH组的下降趋势最明显。通过病理学的观察和分析,各给药组大鼠的跺关节病理状况都有不同程度的缓解,特别是TH组有更明显的缓解。6. TREM-1, DAP 12及细胞因子水平结果显示：与正常组相比,模型组大鼠踝关节中TREM-1, DAP 12的mRNA表达水平及JAK2, STAT3的磷酸化水平明显升高(P<0.0.1,P<0.05),而各给药组大鼠踝关节中TREM-1, DAP 12的mRNA的表达水平和JAK2, STAT3的磷酸化水平则明显下降。同时,模型组大鼠血清和踝关节中TNF-α, IL-1β, IL-6的表达水平明显高于正常组(P<0.01,P<0.05)；与模型组相比,各给药组大鼠血清和踝关节中TNF-α, IL-1β, IL-6的表达水平则明显下降(P<0.05),TH组下降的最明显(P<0.01)。结论：1.我们采用生物信息学方法分析TP作用于RA的新靶点及可能的作用机制,且分析的部分结果与目前的研究有重合,说明这种新的研究方法有一定的可靠性,这可以为以后的研究提供新思路和新方法；2.TP可通过TREM-1/DAP12信号通路来调控炎性因子的表达分泌,从而达到治疗RA的作用。