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目的:观察Pokemon沉默对T-47D细胞中CD44+CD24-细胞群比率及EMT上皮蛋白的影响,研究Pokemon沉默对Smad4表达的作用及作用机制,为进一步深入研究Pokemon侵袭转移机制提供方向?方法:分为二个部分?第一部分:按照Pokemon序列设计特异性的si RNA,将si RNA瞬时转染至T-47D细胞内,提取蛋白后,免疫印迹法检测si RNA对Pokemon的沉默情况;流式分析检测沉默Pokemon对T-47D细胞中CD44+CD24-细胞群比率的影响;免疫印迹法法检测沉默Pokemon对EMT上皮蛋白的影响?第二部分:将携带有Smad4启动子的质粒与Pokemon表达质粒共转至T-47D细胞内,检测荧光素酶活性,免疫印迹法检测沉默Pokemon对Smad4的影响;应用免疫组化法测185例乳腺癌组织中Pokemon及Smad4的表达率,分析二者在临床中的相关性?结果:1)沉默Pokemon可上调T-47D细胞中CD44+CD24-细胞群比例:(1)pokemon-si RNA可下调T-47D细胞中Pokemon的表达,相比较后发现:pokemon-si RNA-002序列沉默效率较高;(2)CD44+CD24-乳腺癌干细胞在阴性对照组和pokemon-si RNA转染组分别是(0.57±0.15)%和(1.10±0.20)%,差异具有统计学意义;2)pokemon-si RNA转染T-47D细胞48h后上皮标志蛋白β-catenin﹑ZO-1、claudin-1表达均明显下调,pokemon-si RNA可能促进细胞发生上皮-间质转化;3)Pokemon在乳腺癌细胞中可通过降低Smad4启动子活性抑制Smad4表达:(1)构建Smad4启动子,并利用荧光素酶报告基因实验检测出Smad4 pp1启动子活性最强?(2)结果显示:共同瞬时转染Pokemon质粒及Smad4启动子24小时后,与对照组相比,Smad4启动子活性明显减低?(3)采用si RNA沉默T-47D细胞Pokemon蛋白的表达后,Smad4的表达水平明显上调,说明细胞水平上Pokemon能抑制Smad4的表达?4)通过对185例人乳腺癌组织(包括各类不同病理类型)进行免疫组化分析,Pokemon与Smad4表达无明显相关性?结论:1)沉默Pokemon的表达能提高T-47D细胞中CD44+CD24-细胞群的比率2)Pokemon在T-47D细胞中可通过降低Smad4启动子活性抑制Smad4表达