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第一部分人牙周膜干细胞(hPDLSCs)的分离、培养与鉴定目的:分离、培养及鉴定人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells.hPDLSCs),为后续实验提供目的细胞。方法:取健康前磨牙根中1/3牙周膜组织,利用酶消化组织块法培养牙周膜原代细胞,通过有限稀释法获得人牙周膜干细胞。流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)表面抗原的表达,茜素红S和油红O染色检测hPDLSCs成骨、成脂诱导,鉴定其多向分化能力;CCK-8法检测细胞增殖能力。结果:1.酶消化组织块法原代培养并通过有限稀释法进行克隆纯化的细胞属贴壁生长,形态呈梭或纺锤状,似成纤维细胞样;2.流式细胞术检测细胞表面抗原显示阳性表达Stro-1,CD146阴性表达CD45;证实所培养细胞为间充质来源细胞;3.21d的成骨、成脂诱导,茜素红S和油红O染色检测阳性,证实所培养细胞的多向分化能力;4.CCK8法检测细胞生长曲线呈“S”形,具有较强的体外增殖能力;结论:健康的人牙周膜组织可经酶消化组织块法体外培养出较强体外增殖能力的牙周膜细胞,有限稀释法可成功分选出具有间充质干细胞特征的hPDLSCs。第二部分Wnt/β-catenin信号通路在雌激素作用下对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化中的调控作用目的:1.探讨雌激素(Estradiol,E2)对hPDLSCs成骨分化的影响;2.探讨雌激素对hPDLSCs内Wnt/β-catenin信号通路的影响;3.采用经典Wnt/β-catenin信号通路激动剂Wnt3a和抑制剂Xav939调控hPDLSCs内Wnt/β-catenin信号通路的表达,从而探究Wnt/β-catenin信号通路在雌激素作用下对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化的调控作用;方法:选取第3代生长状态良好的hPDLSCs作为研究对象,根据不同的处理因素将其分为4个组:空白对照组(Control组)及分别含(10-7ME2组、10-7ME2 + 100ng/mlWnt3a 组、E2 + 5×10-3MXav939 组)的成骨诱导液进行成骨向诱导分化培养的实验组。利用qPCR检测经典Wnt/β-catenin信号通路标志物β-catenin、CyclinD 1及成骨早中晚期标志物ALP、Runx2和OCN在基因水平的表达;采用Western blot从蛋白水平检测经典Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin、GSK3β、P-GSK3β、CyclinD1及成骨细胞特异转录因子Runx2和晚期成骨标志OCN的表达;应用酶联免疫法(ELISA)在成骨诱导1天,3天,5天,7天后检测各组ALP活性。结果:1.hPDLSCs 成骨诱导 7 天后,qPCR 显示:E2 组 hPDLSCs 的 ALP、Runx2及OCN在基因水平较Control组表达明显上调(P<0.001);Western Blot结果显示E2组hPDLSCs的Runx2及OCN在蛋白水平上的表达高于Control组(P<0.05);hPDLSCs成骨诱导1天,3天,5天,7天后ALP活性检测结果显示:E2组ALP蛋白水平高于Control组(P<0.05)。说明E2会促进hPDLSCs的成骨分化。2.hPDLSCs 成骨诱导 7 天后,qPCR 显示:E2 组 hPDLSCs 的β-catenin、CyclinD1在基因水平表达亦明显上调(P<0.001);Western Blot显示:E2 组 hPDLSCs 的 Wnt/β-catenin 信号通路标志物 β-catenin、P-GSK3 β、CyclinD1的表达明显上调(P<0.05),GSK3β蛋白表达下调(P<0.05)。说明雌激素会活化Wnt/β-catenin信号通路。3.hPDLSCs成骨诱导7天后,qPCR显示E2+Wnt3a组的β-catenin和CyclinD1的表达较E2组 E2+Xav939组(P<0.001),E2+Xav939 组的β-catenin、CyclinD1 的表达低于 E2 组(P<0.001);Western Blot 显示:E2+Wnt3a 组的β-catenin、P-GSK3β、CyclinD1 的表达较 E2 组,E2+Xav939组高(P<0.05),同时 GSK3β表达低于 E2 组,E2+Xav939 组(P<0.05);E2+Xav939组的β-c&tenin、P-GSK3β、CyclinD1的表达较E2组低(P<0.05),同时GSK3β表达高于E2组(P<0.05)。说明Wnt3a/Xav939能激活/抑制hPDLSCs内Wnt/β-catenin信号通路。hPDLSCs成骨诱导1天,3天,5天,7天后ALP活性检测结果显示,E2+Wnt3a组的的表达较E2组,E2+Xav939组高(P<0.05),E2 组在 1d,3d 的 ALP 表达高于 E2+Xav939 组(P<0.05),在5d,7d的表达与E2+Xav939组无统计学差异(P>0.05)。hPDLSCs 成骨诱导 7 天后,qPCR 显示:E2+Wnt3a 组的 ALP,Runx2及 OCN 的表达较 E2 组,E2+Xav939 组高(P<0.001),E2 组与 E2+Xav939组间无统计学差异(P>0.05);Western Blot显示:E2+Wntβa组的Runx2,OCN 的表达较 E2 组,E2+Xav939 组高(P<0.05),E2 组与 E2+Xav939组间无统计学差异(P>0.05)。表明Wnt/β-catenin信号通路活化会促进雌激素介导下的hPDLSCs骨向分化,而抑制Wnt/β-catenin信号通路不会明显减弱雌激素介导下的hPDLSCs骨向分化。结论:1.Wnt/β-catenin信号通路参与了 hPDLSCs骨向分化的调控。2.雌激素能活化hPDLSCs中的Wnt/β-catenin信号通路,促进hPDLSCs骨向分化。3.Wnt/β-catenin信号通路参与雌激素作用下的hPDLSCs成骨分化,在雌激素作用环境下,Wnt3a会激活Wnt/β-catenin信号通路,且进一步增强hPDLSCs成骨分化;Xav939会抑制Wnt/β-catenin信号通路,但对hPDLSCs成骨分化未见明显抑制作用。