躯体感觉神经元是机体感觉系统的重要组成部分,其胞体存在于背根神经节(dorsal root ganglion,DRG),DRG神经元外周轴突末梢可感受各种各样的外周刺激例如温度刺激、化学刺激和机械刺激等,并将其转化为神经冲动向中枢传递,从而形成温度觉、痛觉和触觉等感觉。我们前期的研究发现DRG神经元不仅具有痛觉信号形成和传递作用,而且还兼具痛觉信号调节作用。DRG局部存在功能性的GABA回路系统,DRG组织和培养细胞在多种兴奋性刺激作用下可有GABA释放,DRG局部应用GABA对缓激肽诱发的急性炎性疼痛有显著的抑制作用。这些均提示DRG部位(特别是该部位的GABA系统)可能作为疼痛治疗的潜在靶点。慢性神经病理性疼痛是临床常见疾病,其发病机制尚不清楚,目前临床针对慢性神经病理性疼痛尚缺乏有效的治疗手段。本论文中我们将重点关注DRG局部GABA系统在慢性神经病理性疼痛的发生和治疗中的作用。首先,为了研究DRG局部GABA系统在疼痛发生过程中的作用,我们建立了一个全新的“sniffer patch”电生理实验方法,证明大鼠DRG神经元在兴奋情况下可直接释放GABA,这为DRG局部存在功能性的GABA系统提供了更直接的证据。其次,我们通过制备大鼠坐骨神经慢性挤压损伤(CCI)神经病理性疼痛模型,观察疼痛进展期DRG神经元GABA电流密度的改变,以研究DRG局部GABA系统在神经病理性疼痛发生中的作用。最后,我们通过渗透泵靶向DRG给药系统,观察GABA对神经性病理性疼痛反应的影响,分析DRG局部GABA系统作为慢性神经病理性疼痛治疗靶点的可能性。第一部分通过“Sniffer Patch”方法证明DRG神经元的GABA释放功能目的:建立一种全新的电生理实验方法“sniffer patch”,证明DRG神经元具有直接释放GABA的功能。方法:打孔“sniffer patch”电生理实验方法,半定量PCR技术VGAT-ChR2-YFP小鼠鉴定,冰冻切片-免疫荧光技术,统计方法为t检验。结果:①药物刺激DRG神经元“Sniffer Patch”结果:将表达有GABAA受体的HEK293B细胞与大鼠急性分离DRG细胞共培养,与小直径DRG紧密相邻的转染了 GABAA受体的HEK293B细胞在200μLM GABA作用下产生很大的GABA-Cl-电流。而当给予TRPV1受体的激动剂辣椒素激活小直经DRG神经元,用sniffer patch的方法在相邻HEK293B细胞记录到类似的GABA样电流。而辣椒素不能诱发单独培养的转染了 GABAA受体的HEK293B细胞,以及与DRG共培养的空白HEK293B细胞产生任何电流。②机械刺激DRG神经元的“Sniffer Patch”结果:GABAA受体转染HEK293B细胞与大鼠DRG细胞共培养,给予表达有GAB AA受体的HEK293B细胞紧密相邻的小直径DRG机械刺激,未能诱发HEK293B细胞产生GABA样电流。③光激活VGAT-ChR2-YFP 小鼠 DRG 神经元的“Sniffer Patch”结果:分离VGAT-ChR2-YFP小鼠DRG细胞,如上述方法进行共培养,在473nm激光刺激下,在与转基因小鼠VGAT-ChR2-YFP的DRG紧密相邻的表达有GABAA受体的HEK293B细胞记录到一个小的内向电流,比在单独培养的表达有GABAA受体的HEK293B细胞,以及与野生型小鼠的DRG紧密相邻的表达有GABAA受体的HEK293B细胞记录的电流大,且具有统计学意义。结论:大鼠DRG神经元在capsaicin刺激下可直接释放GABA,转基因小鼠VGAT-ChR2-YFP的DRG神经元在473 nm激光刺激下也有类似GABA释放现象,从而证实了 DRG神经元具有直接释放GABA的功能。为DRG局部存在功能性的GABA系统提供了更直接的证据。第二部分DRG部位GABA系统对神经病理性疼痛的影响目的:研究CCI手术后不同直径大小DRG神经元的GABA电流密度的改变。采用渗透泵靶向DRG给药的给药方法,观察DRG局部GABA系统对病理性疼痛的治疗作用。方法:制备神经病理性模型CCI;应用Von Frey纤维刺痛针和热刺痛仪,测定大鼠机械痛、热痛阈值;建立渗透泵靶向DRG给药系统;全细胞膜片钳技术;统计方法为两个独立样本的非参数检验Mann-Whitney Test。结果:①CCI模型建立:CCI组出现明显的痛觉过敏症状,其机械痛和热痛阈值在术后第一天明显下降,并持续至第十四天,与对照组比存在显著性差异(P<0.05)。②电生理结果:用电生理技术分别记录大鼠CCI手术后第五天和第十四天的术侧和对侧大鼠大、中、小直径L4-6DRG神经元的GABA-Cl-电流。大直径和小直径L4-6DRG神经元CCI术后第五天、第十四天术侧DRG神经元的电流密度和对GABA的反应数目与对侧DRG神经元无明显区别。中等直径L4-6DRG神经元在CCI术后第五天大鼠术侧的DRG神经元GABA-C1-电流密度大于对侧(P<0.05),而第十四天术侧与对侧无显著区别。第五天和第十四天对侧的DRG神经元对GABA有反应的神经元数目远少于术侧。③行为学实验结果:通过渗透泵靶向DRG给药系统对CCI模型大鼠部位持续给予GABA(200μM)个周,对照组给予生理盐水;在术前及术后第1,5,7,10,14天进行机械痛和热痛实验的测定。结果显示GABA的应用可使术后第一和第五天热痛阈值明显增大(P<0.05),而GABA的应用对CCI大鼠机械痛阈无明显影响。结论:以上实验证明在神经病理性疼痛发生中伴有一定DRG局部GABA系统敏感性变化,特别是中直径DRG神经元GABA敏感性增高更为明显;在神经病理性疼痛发生过程中激活DRG局部GABA系统可一定程度上缓解疼痛症状,尤其是对热痛过敏症状的缓解作用更为突出。