骨肉瘤（OS,osteosarcoma）也被称作成骨肉瘤,是临床上在青少年和儿童中表现出常发性的一种骨科类恶性肿瘤,它是从骨骼间质细胞系发展而来,其病理特征是生长迅速、恶性程度高、易复发并且容易发生远端转移。目前关于骨肉瘤的发病原因还不完全清楚,因此研究骨肉瘤的发病机制和生物学过程对于骨肉瘤的治疗具有重要的意义。长链非编码RNA（long non-codingRNA,lncRNA）已被研究和报道在多种肿瘤中发挥促癌的作用。我们在前期的研究工作中发现并证实LINC00665在骨肉瘤细胞中的表达水平相较于正常成骨细胞显著高表达,但是LINC00665在骨肉瘤发生过程中发挥的作用和调控机制目前还不清楚。本课题围绕LINC00665对骨肉瘤细胞增殖、侵袭转移和EMT的影响展开研究,探究LINC00665在骨肉瘤发生发展中的作用和调控机制。体外实验的检测结果显示,在骨肉瘤细胞中干扰LINC00665的表达能够有效抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭转移能力,抑制骨肉瘤细胞发生EMT现象,同时能够有效促进骨肉瘤细胞的凋亡,对骨肉瘤细胞的恶性表型起到明显的抑制作用。以上的研究结果表明,LINC00665在骨肉瘤细胞中高表达,对骨肉瘤的发生和恶性表型的形成起到促进的作用,确认LINC00665是骨肉瘤中发挥促癌作用的重要调控基因。已有大量科学研究报道了lncRNA在肿瘤的发生发展过程中起到重要的调控作用,lncRNA在肿瘤发生过程中存在多种调控机制,其中ceRNA机制是lncRNA在肿瘤中最为常见的一种作用模型,已被科研工作者们密切关注。由于lncRNA序列上存在丰富的miRNA结合位点,与miRNA之间可以通过碱基互补配对的方式相互结合,因而在细胞内lncRNA可以起到分子海绵的作用,能够与mRNA竞争性结合miRNA,同时阻断miRNA对mRNA的抑制作用,调控mRNA表达水平上调表达,间接地促进mRNA翻译成蛋白,从而影响肿瘤的发生发展过程。细胞核质分离实验所得RNA产物的RT-qPCR检测结果和RNA FISH的荧光图片显示,LINC00665的表达分布主要位于细胞质中,结合现有的关于LINC00665在其他肿瘤中的研究报道,LINC00665在骨肉瘤中可能通过ceRNA机制发挥调控作用。通过在线生物信息学预测网站预测获得与LINC00665存在结合可能的miRNA,随后借助MS2-RIP实验确认LINC00665在骨肉瘤细胞中与miR-1249-5p结合密切。同时AGO2-RIP的验证实验结果也论证LINC00665和miR-1249-5p通过RISC复合体相互作用,同时在分子水平上LINC00665能够抑制miR-1249-5p的表达,细胞功能实验也证实LINC00665可以通过抑制miR-1249-5p促进骨肉瘤的发生。为寻找在骨肉瘤中受LINC00665调控最显著的肿瘤相关信号通路,借助QIAGEN的Cignal Reporter Assay试剂盒检测骨肉瘤中活性改变最显著的肿瘤相关信号通路,发现其中WNT信号通路在LINC00665被干扰的条件下活性降低最显著。WNT信号通路与肿瘤发生发展存在重要相关性,在现有的研究报道,大量的研究成果证实WNT信号通路的异常活化对肿瘤的形成和发展起到促进作用。本课题在进一步地研究中,LINC00665的表达水平能够显著影响WNT信号通路的活性,当在骨肉瘤细胞中干扰LINC00665的表达后WNT信号通路活性显著性降低。我们猜想LINC00665可能通过miR-1249-5p调控WNT信号通路的活性。进一步地,为寻找受miR-1249-5p调控的WNT通路相关基因,我们借助生物信息学的分析方法获得miR-1249-5p的潜在靶基因,从预测结果中发现存在有10个WNT家族蛋白,并根据Target Scan数据库提供的结合可靠性评分以及在骨肉瘤细胞水平的验证实验结果,从10个WNT家族基因中筛出受miR-1249-5p调控最显著的下游靶基因WNT2B,初步获得LINC00665/miR-1249-5p/WNT2B信号轴,并在分子水平上验证三者通过ceRNA机制发挥调控作用,在细胞功能实验中验证该信号轴能够有效地促进骨肉瘤细胞的增殖、侵袭转移和EMT,同时能够对骨肉瘤细胞发生凋亡起到显著的抑制作用。我们在细胞水平上验证了LINC00665/miR-1249-5p/WNT2B信号轴能够激活WNT信号通路,并且WNT信号通路也能够正反馈作用于LINC00665并促进LINC00665的表达,同时荧光素酶活性报告基因的检测结果也显示激活WNT信号通路能够有效增强LINC00665的启动子活性。LEF/TCF转录复合体是WNT信号通路下游参与转录调控过程的核心转录因子,能够激活参与调控细胞增殖、周期和侵袭转移等生理过程的下游靶基因的表达,对肿瘤的发生发展起到促进作用。生物信息学预测的结果显示LEF/TCF转录复合体在LINC00665的启动子区序列上有两个潜在结合位点,提示TCF/LEF转录复合体可能参与了LINC00665的转录过程,同时染色质免疫共沉淀实验和LINC00665启动子的荧光素酶报告基因实验结果也进一步证实LEF/TCF转录复合体结合在LINC00665的启动子区上。由此,我们得出结论:LINC00665/miR-1249-5p/WNT2B信号轴激活WNT信号通路促进骨肉瘤细胞的增殖、侵袭转移和EMT,活化的WNT信号通路正反馈促进LINC00665的表达与LINC00665/miR-1249-5p/WNT2B信号轴形成闭环回路,在骨肉瘤形成过程中起到促癌的作用。本课题在分子水平上论证了LINC00665在骨肉瘤中高表达并促进骨肉瘤发生的作用机制,丰富了骨肉瘤发生的调控网络,同时LINC00665、WNT2B和WNT信号通路是骨肉瘤发生的关键调控节点,这些节点的发现对骨肉瘤的临床靶向治疗具有十分重要的意义。目的1.通过实时定量PCR的实验方法,检测骨肉瘤细胞系和正常成骨细胞中LINC00665的表达水平,明确LINC00665在骨肉瘤细胞中显著高表达;在体外细胞实验中干扰LINC00665的表达,采用CCK8、EDU检测、克隆形成实验检测LINC00665表达水平对骨肉瘤细胞增殖的影响,采用caspase 3活性检测和Tunel实验检测LINC00665表达水平对骨肉瘤细胞凋亡的影响,采用划痕实验和transwell实验方法检测LINC00665表达水平对骨肉瘤细胞侵袭转移的影响,采用免疫荧光和western blot实验检测LINC00665对骨肉瘤细胞发生EMT现象的影响,验证LINC00665促进骨肉瘤的发生。2.探究LINC00665促进骨肉瘤发生发展的分子机制,揭示LINC00665通过ceRNA的作用机制在骨肉瘤细胞中作为分子海绵调控miR-1249-5p/WNT2B信号轴激活WNT信号通路,促进骨肉瘤细胞的增殖、侵袭转移和EMT,在骨肉瘤的发生发展过程中起到促癌作用。3.揭示WNT信号通路在转录水平上调LINC00665的表达,与LINC00665/miR-1249-5p/WNT2B信号轴形成正反馈回路。材料与方法1.检测LINC00665在骨肉瘤细胞系和正常成骨细胞中的表达水平:实验室现有细胞状态良好的四株骨肉瘤细胞系（U20S,MG-63,SAOS-2,143B）和一株人胎儿成骨细胞系（h FOB）,以h FOB细胞作为正常对照。将细胞接种在含有10%FBS的DMEM培养基中,然后置放在37℃、5%CO₂条件的细胞培养箱进行扩大培养。提取细胞的总RNA并进行RT-qPCR检测:将状态良好的细胞经过离心处理后收集细胞团块,采用Trizol法获得各细胞的总RNA。将从各组样品中提取到的总RNA进行反转录,加入LINC00665的特异性qPCR引物,检测LINC00665在不同细胞样本中的表达水平。2.细胞功能实验检测:分别在转染sh-LINC00665干扰表达载体和阴性对照载体sh-NC的骨肉瘤细胞中,利用CCK8实验、EDU实验、克隆形成实验检测LINC00665表达水平对骨肉瘤细胞增殖活性的影响;利用caspase 3活性检测实验和Tunel实验检测LINC00665表达水平对骨肉瘤细胞凋亡活性的影响;利用划痕实验和trasnwell实验检测LINC00665表达水平对骨肉瘤细胞侵袭转移能力的影响;利用蛋白免疫荧光实验和western blot实验检测LINC00665表达水平对骨肉瘤细胞EMT的影响。3.检测LINC00665在骨肉瘤细胞中的定位:采用细胞核和细胞质分离技术对骨肉瘤细胞进行核质分离处理,用Trizol法分别提取细胞核中的RNA和细胞质中的RNA,检测体系中以GAPDH作为细胞质分布基因的阳性参照,以U6作为细胞核分布基因的阳性参照,经过RT-qPCR的方法检测LINC00665在细胞质与细胞核中的表达水平;将带有荧光基团的特异性探针对LINC007665进行标记,在荧光显微镜下观察LINC00665在骨肉瘤细胞中的分布。4.生物信息学预测与LINC000665存在结合可能的miRNA:借助在线网站DIANA tools获得与LINC00665存在结合可能的miRNA,取排名最靠前的前五位,分别是:miR-1249-5p、miR-6891-5p、miR-6785-5p、miR-4728-5p、miR-6780a-5p。5.MS2-RIP实验验证LINC00665与miRNA的结合:将LINC00665的序列构建到MS2载体上并转染到骨肉瘤细胞中,经过体外培养48小时后收集细胞,使用细胞裂解液对细胞进行处理,并用MS2蛋白的特异性抗体捕获MS2蛋白及LINC00665序列上结合的miRNA,将RNA产物经过纯化后检测5个miRNA在MS2系统上的结合量,筛选出与LINC00665结合最密切的miR-1249-5p。6.RT-qPCR检测miR-1249-5p在骨肉瘤细胞中的表达水平及LINC00665对miR-1249-5p表达水平的影响。7.miRNA pull-down实验反向验证miR-1249-5p与LINC00665结合:根据miR-1249-5p的基因序列制备带有生物素标记的miRNA探针,将miR-1249-5p探针与骨肉瘤细胞的裂解液充分混匀钓取与miR-1249-5p结合的RNA,将RNA产物经过提取和纯化后检测LINC00665的吸附量。8.AGO2-RIP实验检测RISC复合体中LINC00665和miR-1249-5p的含量:选用RISC复合体核心蛋白AGO2的IP级别抗体进行RIP实验,捕货得到RISC复合体中的RNA,将RNA产物经过提取和纯化后,RT-qPCR实验检测LINC00665和miR-1249-5p在RISC复合体中的含量。9.生物信息学预测miR-1249-5p在LINC00665序列上的结合位点:在NCBI数据库中获得LINC00665的基因序列,从miRBase数据库中获得miR-1249-5p的基因序列,基于碱基互补配对原则和miRNA种子区的保守性,寻找LINC00665序列上与miR-1249-5p互补配对区域,即为miR-1249-5p在LINC00665序列上的潜在结合位点。10.荧光素酶报告基因分析:构建含有LINC00665的野生型序列和突变miRNA结合位点序列的荧光素酶报告基因载体,在骨肉瘤细胞系MG-63、143B细胞中分别将野生型和突变型报告基因载体与miR-1249-5p模拟物和阴性对照miR-NC进行共转染,细胞在体外培养48小时后进行裂解处理,然后在多功能酶标仪中分别检测各组细胞中的荧光素酶活性。11.拯救实验验证LINC00665/miR-1249-5p在骨肉瘤细胞中发挥促癌作用:在分组为sh-NC,sh-LINC00665,sh-LINC00665+miR-1249-5p inhibitor的拯救实验组中进行CCK8、EDU、克隆形成实验、caspase 3活性检测实验、Tunel、划痕、transwell实验及蛋白免疫荧光实验,检测LINC00665/miR-1249-5p信号轴对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭转移和EMT的影响。12.检测LINC00665对骨肉瘤细胞中信号通路的影响:采用Cignal Reporter Assay试剂盒,在转染sh-LINC00665和sh-NC的骨肉瘤细胞中检测与肿瘤发生密切相关信号通路的活性,寻找骨肉瘤细胞中受LINC00665表达水平影响最显著的信号通路。13.寻找miR-1249-5p的下游靶基因:根据Cignal Reporter Assay试剂盒的芯片结果,确认LINC00665表达水平与WNT信号通路的活性存在密切相关性,通过在线数据库Target Scan获得miR-1249-5p的下游靶基因,并从中筛选出10个WNT家族基因,其中miR-1249-5p与靶基因WNT2B结合的得分最高。14.确认WNT2B是miR-1249-5p的下游靶基因:RT-qPCR和western blot实验检测骨肉瘤细胞系中WNT2B的mRNA和蛋白表达水平;检测miR-1249-5p对靶基因WNT2B表达水平的影响。15.生物信息学预测miR-1249-5p在靶基因WNT2B 3’UTR区上的潜在结合位点:根据Ensembl数据库获得WNT2B的3’UTR区序列,基于碱基互补配对原则和miRNA种子区的保守性,寻找WNT2B的3’UTR序列上与miR-1249-5p互补配对区域,即为miR-1249-5p在WNT2B的3’UTR序列上的潜在结合位点。16.miRNA pull-down实验检测miR-1249-5p在WNT2B的3’UTR序列上的结合位点:将miR-1249-5p带有生物素标记的RNA探针与骨肉瘤细胞的裂解液充分混合钓取与miR-1249-5p探针结合的RNA,将RNA产物经过提取和纯化后检测WNT2B的3’UTR序列上潜在结合位点的富集量。17.荧光素酶报告基因实验验证miR-1249-5p在潜在结合位点与WNT2B的3’UTR序列结合:构建含有WNT2B 3’UTR的野生型序列和突变miR-1249-5p结合位点序列的荧光素酶报告基因载体,分别将野生型和突变型报告基因载体与miR-1249-5p模拟物和阴性对照miR-NC共转染到骨肉瘤细胞系MG-63、143B细胞中,经过体外培养48小时,然后在多功能酶标仪上检测各组细胞中的荧光素活性。18.AGO2-RIP实验验证LINC00665、miR-1249-5p和WNT2B 3’UTR结合在RISC复合体中:在AGO2-RIP的RNA产物中同时检测LINC00665、miR-1249-5p和WNT2B3’UTR的富集量,验证三者都结合在RISC复合体上。19.拯救实验验证LINC00665吸附miR-1249-5p调控WNT2B的表达:在分组为sh-NC,sh-LINC00665,sh-LINC00665+pc DNA-WNT2B的拯救实验组细胞中,RT-qPCR实验检测WNT2B的mRNA表达水平,western blot实验检测WNT2B的蛋白表达水平。20.细胞水平拯救实验验证LINC00665/miR-1249-5p/WNT2B信号轴在骨肉瘤中促进肿瘤发生:在分组为sh-NC,sh-LINC00665,sh-LINC00665+pc DNA-WNT2B的骨肉瘤细胞拯救实验组中进行CCK8、EDU、克隆形成实验、caspase 3活性检测实验、Tunel、划痕、transwell实验及蛋白免疫荧光实验,检测LINC00665/miR-1249-5p/WNT2B信号轴对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭转移和EMT的影响。21.TOP/FOP荧光素酶报告基因验证LINC00665/miR-1249-5p/WNT2B信号轴激活WNT信号通路:在拯救实验分组为sh-NC,sh-LINC00665,sh-LINC00665+pc DNA-WNT2B的骨肉瘤细胞中检测TOP/FOP荧光素酶报告基因活性,验证LINC00665/miR-1249-5p/WNT2B信号轴对WNT信号通路活性的影响。22.检测LINC00665/miR-1249-5p/WNT2B信号轴激活WNT信号通路及下游基因表达:在转染LINC00665干扰表达载体sh-LINC00665和阴性对照载体sh-NC的骨肉瘤细胞中,采用RT-qPCR和western blot技术方法验证WNT信号通路基因WNT2B、β-catenin、LEF1及WNT信号通路下游基因c-MYC、CCND1、CDK4、MMP2、Snail的mRNA和蛋白表达水平受LINC00665表达水平的影响。23.检测WNT信号通路影响LINC00665的表达水平:分别在骨肉瘤细胞中加入WNT信号通路激动剂Li Cl和DMSO,RT-qPCR检测不同处理条件下的骨肉瘤细胞中LINC00665的表达水平。24.生物信息学预测TCF/LEF转录复合体在LINC00665启动子区上的结合位点:从JASPAR数据库中获得TCF/LEF转录复合体的DNA motif序列,从UCSC数据库中获得LINC00665的TSS位点上游2000bp长度区域的DNA序列（即为LINC00665的启动子区）,将TCF/LEF的DNA motif序列与LINC00665的启动子序列进行匹配,获得TCF/LEF转录复合体在LINC00665启动子区上潜在的结合位点,并根据结合位点设计特异性的qPCR引物,用于后续染色质免疫共沉淀的产物检测。25.染色质免疫共沉淀实验验证TCF/LEF转录复合体结合LINC00665的启动子区:通过染色质免疫共沉淀实验获得与LEF1及其转录复合体结合的DNA片段,将DNA片段经过提取和纯化,采用qPCR实验检测DNA产物中LINC00665的启动子区上潜在结合位点所在片段的富集量。26.启动子荧光素酶活性检测实验验证LEF/TCF转录复合体在LINC00665启动子区上的结合位点:分别构建LINC00665启动子区的野生型序列和TCF/LEF转录复合体结合位点区域突变的突变型序列,将野生型序列和突变型序列连入到PGL3荧光素酶报告基因载体上,分别在经过DMSO处理和Li Cl处理的骨肉瘤细胞中转染LINC00665的野生型和突变型荧光素酶报告基因,验证预测结合位点是TCF/LEF转录复合体在LINC00665启动子区上的实际结合位点。结果1.LINC00665在骨肉瘤细胞系中的表达水平相较于LINC00665在正常成骨细胞中的表达水平显著增高,其中LINC00665在MG-63和143B中上调表达最为显著。2.转染sh-LINC00665的骨肉瘤细胞MG-63和143B中LINC00665的表达水平显著降低,细胞功能实验的检测结果表明:干扰LINC00665的表达能够显著抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭转移和EMT,同时干扰LINC00665后骨肉瘤细胞的凋亡水平显著升高。3.对照骨肉瘤细胞核质分离实验和RNA FISH实验的检测结果,发现LINC00665在细胞核与细胞质中都有表达分布,但是主要位于细胞质中。4.生物信息学预测得到与LINC000665存在结合可能的miRNA,其中miR-1249-5p、miR-6891-5p、miR-6785-5p、miR-4728-5p、miR-6780a-5p排在前五位。5.MS2-RIP实验证实,生物信息学预测结果中排名前五的miRNA里miR-1249-5p在骨肉瘤细胞中与LINC00665结合最密切。6.miR-1249-5p在骨肉瘤细胞中的表达水平相较于正常成骨细胞显著降低;干扰LINC00665能够促进miR-1249-5p的表达水平显著升高,实验结果表明在骨肉瘤细胞中LINC00665对miR-1249-5p表达水平起到抑制作用。7.miRNA pull-down实验反向验证miR-1249-5p能够与LINC00665特异性结合。8.AGO2-RIP实验检测RISC复合体中LINC00665和miR-1249-5p的含量:选用RISC复合体核心蛋白AGO2的IP级别抗体进行RIP实验,捕获得到RISC复合体中的RNA,将RNA产物经过提取和纯化后,RT-qPCR实验检测LINC00665和miR-1249-5p在RISC复合体中的含量。9.生物信息学预测的结果显示,miR-1249-5p在LINC00665序列上存在潜在的结合位点。10.荧光素酶报告基因的检测结果表明,LINC00665的野生型报告基因会受miR-1249-5p mimics的影响导致活性降低,而突变型则无显著性变化,表明生物信息学预测所得结合位点是miR-1249-5p在LINC00665序列上的实际结合位点。11.细胞功能拯救实验的检测结果表明,LINC00665/miR-1249-5p信号轴在骨肉瘤细胞中促进骨肉瘤细胞的增殖、侵袭转移和EMT,抑制骨肉瘤细胞的凋亡,在骨肉瘤中发挥促癌作用。12.Cignal Reporter Assay试剂盒的检测结果显示,干扰LINC00665的表达水平后骨肉瘤细胞中WNT信号通路、p RB-E2F信号图及Myc信号通路的活性都显著性降低,其中WNT信号通路的活性降低最显著。13.借助在线数据库Target Scan获得miR-1249-5p的下游靶基因,并从中筛选出10个WNT家族基因,其中miR-1249-5p与靶基因WNT2B结合的得分最高。14.RT-qPCR和western blot实验检的检测结果显示,WNT2B的mRNA和蛋白在骨肉瘤细胞中的表达水平相较于正常成骨细胞显著高表达;miR-1249-5p对WNT2B的mRNA和蛋白表达水平起到显著的抑制作用。15.生物信息学预测的结果显示,miR-1249-5p在靶基因WNT2B 3’UTR区上有4个潜在结合位点。16.miRNA pull-down实验的RNA产物中检测WNT2B 3’UTR序列上4个潜在结合位点的富集情况,发现第一预测位点在RNA产物中高度富集,表明miR-1249-5p在第一预测位点与WNT2B 3’UTR序列结合最显著。17.荧光素酶报告基因实验的检测结果显示,miR-1249-5p mimics对第一预测位点的野生型报告基因荧光素酶活性起到显著的抑制作用而对突变型荧光素酶报告基因的荧光素酶活性无显著性影响,表明第一预测位点是miR-1249-5p在靶基因WNT2B的mRNA 3’UTR区上的真实结合位点。18.RT-qPCR的检测结果显示,LINC00665、miR-1249-5p和WNT2B 3’UTR在AGO2-RIP实验的RNA产物中都呈现出显著富集,表明三者都结合在RISC复合体上。19.分子水平上的拯救实验检测结果显示,LINC00665吸附miR-1249-5p促进WNT2B的mRNA和蛋白表达。20.细胞水平的拯救实验检测结果显示,LINC00665/miR-1249-5p/WNT2B信号轴在骨肉瘤中促进骨肉瘤细胞的增殖能力,抑制骨肉瘤细胞发生凋亡,同时对骨肉瘤细胞的侵袭转移和EMT也起到促进的作用。21.TOP/FOP荧光素酶报告基因实验的检测结果显示,干扰LINC00665的表达后WNT信号通路的活性降低,而在干扰LINC00665的情况下过表达WNT2B后WNT信号通路的活性升高,表明LINC00665/miR-1249-5p/WNT2B信号轴能够有效激活WNT信号通路的活性。22.在干扰LINC00665表达的骨肉瘤细胞中,WNT信号通路上的基因WNT2B、β-catenin、LEF1及WNT信号通路下游基因c-MYC、CCND1、CDK4、MMP2、Snail的mRNA和蛋白表达水平降低,进一步验证了LINC00665对WNT信号通路的激活效果。23.RT-qPCR的检测结果显示,在骨肉瘤细胞中加入WNT信号通路激动剂Li Cl后LINC00665的表达水平相较于DMSO细胞中显著升高,表明WNT信号通路对LINC00665的表达起到促进的作用。24.生物信息学预测结果显示TCF/LEF转录复合体在LINC00665启动子区上具有两个可能的结合位点。25.在染色质免疫共沉淀实验的DNA产物中检测第一预测位点和第二预测位点的富集量,qPCR的检测结果显示在第二预测位点检测到显著的结合信号,表明TCF/LEF转录复合体在第二预测位点与LINC00665的启动子区存在结合的可能性。26.LINC00665启动子区的荧光素酶报告基因实验检测结果表明,加入WNT信号通路激动剂Li Cl能够显著增强第二结合位点的野生型荧光素酶报告基因的启动子活性,而突变第二结合位点的荧光素酶报告基因活性无显著性变化,表明第二预测位点是TCF/LEF转录复合体在LINC00665启动子区上的实际结合位点。结论1.LINC00665在骨肉瘤细胞系中显著高表达,敲低LINC00665后骨肉瘤细胞增殖、迁移转移和EMT受到明显的抑制,细胞的凋亡水平则显著增加,LINC00665在骨肉瘤细胞中起到促癌的作用;2.LINC00665在骨肉瘤中作为miRNA分子海绵通过LINC00665/miR-1249-5p/WNT2B信号轴激活WNT信号通路发挥促癌作用;3.WNT信号通路下游TCF/LEF转录复合体在转录水平上能够促进LINC00665的转录,与LINC00665/miR-1249-5p/WNT2B信号轴形成正反馈回路;4.本课题在分子水平上论证了LINC00665在骨肉瘤中高表达并促进骨肉瘤发生的作用机制,丰富了骨肉瘤发生的调控网络,同时LINC00665、WNT2B和WNT信号通路是骨肉瘤发生中的关键调控节点,这些节点的发现对骨肉瘤的临床靶向治疗具有十分重要的意义。