第一部分磷酸化i TRAQ技术筛选a PKC-ι直接磷酸化底物Sp1(Ser59)目的:检测aPKC-ι的直接磷酸化底物及位点,探讨aPKC-ι调控胆管癌上皮-间质细胞转化(EMT)及免疫抑制的分子机制。方法:将a PKC-ι-c DNA表达载体转导入人胆管癌细胞系中,构建稳定过表达a PKC-ι的人胆管癌细胞系并设置为实验组,对照组为空转病毒组。应用基于磷酸化i TRAQ(Isobaric tag for relative and absolute quantitation,i TRAQ)技术的定量蛋白质组学研究,筛选出差异表达的磷酸化位点、肽段及蛋白质,并进行生物信息学分析,如GO分析、KEGG富集分析、蛋白质互作网络分析等。选取参与EMT过程的相关信号通路中差异表达的磷酸化蛋白位点,应用WB、IF进行验证;结合免疫共沉淀实验(Co-IP)检测该磷酸化蛋白在胆管癌组织及细胞中与a PKC-ι的相互结合关系,论证其是否为a PKC-ι的直接磷酸化底物。结果:定量磷酸化蛋白质组学研究发现,稳定过表达aPKC-ι的胆管癌细胞与未经任何处理的胆管癌细胞相对比,共有311个差异表达的磷酸化肽段被鉴定出,对应247个磷酸化蛋白(差异倍数≥1.2,P value<0.05)。其中,169个磷酸化肽段表达上调,142个磷酸化肽段表达下调。经过生物信息学分析,发现EMT过程中重要的TGF-β信号通路相关分子蛋白,即转化因子特化蛋白1(Specificity protein 1,Sp1)的丝氨酸59位点(Ser59)磷酸化水平上调。WB、IF检测证实过表达a PKC-ι的胆管癌细胞系中Sp1、Sp1 Ser59位点磷酸化(P-Sp1)水平显著上调。Co-IP实验显示,a PKC-ι与Sp1在胆管癌组织及细胞中存在直接结合的关系。结论:a PKC-ι催化Sp1 Ser59位点的磷酸化,Sp1 Ser59是a PKC-ι的直接磷酸化位点。第二部分P-Sp1表达与a PKC-ι/Snail、免疫细胞浸润及胆管癌预后的关系目的:结合临床资料,明确胆管癌组织中P-Sp1的表达与a PKC-ι/Snail表达、免疫细胞浸润及胆管癌病人预后的关系。方法:选取2012年1月至2016年3月期间的64例胆管癌病人的癌组织、癌旁组织标本。运用免疫组化(IHC)、WB检测上述组织中Sp1、P-Sp1、a PKC-ι、Snail和免疫细胞表型分子CD4、CD8、CD25和Foxp3的表达;Spearman相关性分析法分析P-Sp1与上述蛋白表达的相关性,卡方检验和t检验分析Sp1、P-Sp1与胆管癌病人临床病理特征(如TNM分期、分化程度、淋巴结转移等)的相关性;Kaplan-Meier法分析Sp1、P-Sp1的表达与胆管癌病人预后的关联;Cox多因素回归分析Sp1、P-Sp1对胆管癌病人预后的影响。结果:Sp1、P-Sp1与a PKC-ι、Snail和免疫细胞表型分子CD4、CD25、Foxp3在胆管癌组织中均显著高表达,而癌旁组织中低表达;CD8在胆管癌组织中低表达,癌旁组织中高表达。P-Sp1与a PKC-ι、Snail、CD4、CD25、Foxp3在胆管癌组织中协同高表达,呈正相关,而与CD8表达呈负相关。Sp1、P-Sp1的高表达与胆管癌临床病理特征密切相关,表现为当P-Sp1表达越高时,相应的胆管癌分化程度越低,TNM分期越高,淋巴结转移阳性率也越高;高表达Sp1、P-Sp1的胆管癌病人平均生存时间显著低于低表达者;Cox多因素回归分析显示Sp1、P-Sp1是胆管癌病人预后的危险因素。结论:P-Sp1与a PKC-ι、Snail在胆管癌组织中协同高表达;P-Sp1与免疫细胞表型分子CD4、CD25、Foxp3协同高表达,提示Sp1 Ser59位点磷酸化与免疫细胞浸润有关;P-Sp1、Sp1是胆管癌病人预后的危险因素。第三部分P-Sp1通过调控Snail的转录促进胆管癌上皮-间质细胞转化目的:探讨a PKC-ι介导的Sp1 Ser59位点磷酸化对Snail表达及胆管癌上皮-间质细胞转化的调控作用及机制。方法:利用氨基酸定点突变技术,针对Sp1 Ser59位点构建不同磷酸化水平的表达载体并转染胆管癌细胞系,分别为野生型Sp1组(WT-Sp1),天冬氨酸突变体组(S59D-Sp1,磷酸化状态),丙氨酸突变体组(S59A-Sp1,去磷酸化状态);WB、q RT-PCR、IF检测上述各组细胞系中Snail的表达。Co-IP检测胆管癌组织及细胞中Sp1与Snail的相互结合关系;染色质免疫沉淀技术(Ch IP)检测上述各组细胞系中Sp1与Snail启动子结合强度。WB、q RT-PCR、IF检测胆管癌细胞系中EMT标志物的表达,Transwell侵袭实验、划痕实验检测胆管癌细胞侵袭、迁移能力,CCK8增殖实验检测胆管癌细胞增殖能力。利用上述胆管癌细胞系构建裸鼠肺转移模型,体内检测Sp1 Ser59位点磷酸化对胆管癌细胞侵袭转移能力的影响。结果:与WT-Sp1细胞相比,磷酸化状态的S59D-Sp1细胞Snail呈显著高表达,而去磷酸化状态的S59A-Sp1细胞Snail呈显著低表达。Co-IP实验显示胆管癌组织及细胞中Sp1与Snail存在直接结合的关系,Ch IP实验发现Sp1Ser59位点的磷酸化可以促进Sp1与Snail启动子的结合强度。S59D-Sp1细胞上皮标志物E-cadherin和β-catenin的表达低于WT-Sp1细胞,间质标志物N-cadherin的表达则高于WT-Sp1细胞;而S59A-Sp1细胞结果与之相反。S59D-Sp1细胞的增殖、侵袭、迁移能力强于WT-Sp1细胞,而S59A-Sp1细胞的增殖、侵袭、迁移能力弱于WT-Sp1细胞。体内裸鼠肺转移模型实验表明,S59D-Sp1细胞组的裸鼠肺转移灶数目明显多于WT-Sp1细胞组的裸鼠,S59A-Sp1细胞组则少于WT-Sp1细胞组。IHC、WB证实相比于WT-Sp1细胞组,S59D-Sp1细胞组的肺转移瘤组织中P-Sp1表达升高,而S59A-Sp1细胞组的P-Sp1表达降低。结论:Sp1 Ser59位点磷酸化通过增强Sp1与Snail启动子结合强度,进而促进Snail的表达并诱导胆管癌上皮-间质细胞转化。第四部分P-Sp1介导的胆管癌上皮-间质细胞转化诱导免疫抑制目的:探讨P-Sp1介导的胆管癌细胞EMT对免疫细胞数目及功能的影响及调控机制。方法:将携带差异性P-Sp1水平的表达载体分别转染胆管癌细胞系,以此构建胆管癌EMT模型;提取健康人的外周血单个核细胞(PBMCs),将PBMCs与P-Sp1介导的胆管癌细胞EMT模型共培养5天后,利用CCK8细胞增殖实验检测共培养体系中PBMCs的增殖能力,流式细胞术检测共培养体系PBMCs中CD4+细胞和CD8+细胞所占百分比,以及Foxp3+细胞在CD4+、CD4+CD25-、CD4+CD25+细胞群中所占百分比。免疫磁珠分选出共培养体系中的CD4+细胞,并分别与新鲜CD4+和CD8+T细胞再次共培养,CCK8细胞增殖实验检测再次共培养体系中CD4+和CD8+T细胞增殖能力。进一步利用Transwell小室构建P-Sp1介导的胆管癌细胞EMT模型与PBMCs的间接共培养体系,以及收集胆管癌细胞EMT模型的培养液上清用于培养PBMCs,分别同上观察PBMCs的细胞增殖、CD4+和CD8+细胞数量、Foxp3+细胞在CD4+、CD4+CD25-、CD4+CD25+细胞群中所占百分比等情况。利用ELISA法检测不同P-Sp1表达水平的胆管癌细胞系培养液上清中免疫因子IL-2和TGF-β1的水平。结果:相比于WT-Sp1细胞组,与S59D-Sp1细胞共培养后的PBMCs细胞增殖能力、CD4+细胞和CD8+细胞数量明显下降,而与S59A-Sp1细胞共培养后的PBMCs细胞增殖能力、CD4+细胞和CD8+细胞数量有所上调。S59D-Sp1细胞共培养后的Foxp3+细胞在CD4+、CD4+CD25-细胞群中所占百分比高于WT-Sp1细胞组,S59A-Sp1细胞组则低于WT-Sp1细胞组。S59D-Sp1细胞共培养后的CD4+细胞抑制T细胞增殖的能力也显著增强,S59A-Sp1细胞组则下降。Transwell小室构建的间接共培养体系以及EMT模型培养液上清培养的PBMCs组研究结果均同上述。ELISA检测发现S59D-Sp1细胞分泌的免疫因子IL-2和TGF-β1显著多于WT-Sp1细胞,S59A-Sp1细胞分泌的免疫因子IL-2和TGF-β1则少于WT-Sp1细胞。结论:P-Sp1介导的胆管癌细胞EMT模型中,Sp1 Ser59位点磷酸化通过调控癌细胞分泌免疫因子IL-2和TGF-β1进而促进免疫抑制性CD4+CD25-Foxp3+细胞数目的增多,进一步诱导免疫抑制的发生。