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目的:1.优化大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells,rBMSCs)体外分离、培养、纯化、扩增的方法。2.将构建成功的含有神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)基因的慢病毒载体感染大鼠骨髓间充质干细胞,并观察神经生长因子在骨髓间充质干细胞中的表达,为下一步在动物体内进行基因治疗提供基础。方法:1.全骨髓贴壁培养法行rBMSCs提取、分离、培养,用低糖DMEM+10%胎牛血清作为细胞培养基,倒置显微镜下观察rBMSCs形态及生长,通过传代纯化和扩增,至第二代以后每次传代时取部分细胞分装冻存。2.取第三代rBMSCs流式细胞学鉴定其表面CD标记并进行成骨、成脂诱导分化鉴定。3.以含有NGF基因的慢病毒载体和含有GFP的慢病毒空载体(作为实验对照),感染靶细胞rBMSCs,倒置荧光显微镜下观察感染后的rBMSCs中GFP表达情况。4.以慢病毒空载体做对照,取感染后的rBMSCs培养液上清采用ELISA检测rBMSCs中NGF蛋白的表达。5.以慢病毒空载体做对照,取感染后的rBMSCs提取RNA后行实时荧光定量PCR检测rBMSCs NGF基因mRNA水平的表达。结果:1.全骨髓培养法采集和扩增的rBMSCs生长良好并稳定传代,细胞培养至第3代后呈现比较均一的长梭形、成纤维状形态。流式细胞仪检测扩增后的rBMSCs表面抗原特征,结果表明rBMSCs强表达干细胞表面标记CD44、CD90、CD106,而弱表达甚至不表达造血干细胞特异抗原CD34、CD45等,并且能向成骨、成脂诱导分化,证实为非造血干细胞的另一类干细胞。2.在感染入含神经生长因子基因的慢病毒载体的rBMSCs中,应用实时荧光定量PCR可检测到NGF前体基因的mRNA,其培养液上清应用ELISA方法可检测到NGF蛋白。结论:1.通过全骨髓培养法贴壁筛选成功获取了大量高纯度大鼠骨髓间充质干细胞,可满足进一步体内外实验需求。2.成功利用慢病毒载体将NGF基因转移至大鼠骨髓间充质干细胞,感染后的细胞可分泌出NGF蛋白,为下一步进行体内基因治疗研究提供了较为理想的基因修饰细胞。