本文旨在观察p53基因P1启动子甲基化在急性白血病中的存在情况及其在ANLL与ALL中的异同，并结合临床资料，探讨p53基因甲基化检测在急性白血病诊疗方面的意义。 材料与方法： 实验对象包括急性单核细胞白血病U937细胞株；急性白血病初发或者复发以及慢性白血病急性变患者的骨髓或者外周血标本共3l例；健康体检自愿者外周血标本共11例供对照。 1、U937细胞培养与标本收集 使用RPMI1640培养液(10﹪的小牛血清)，37℃，5﹪CO2培养箱内常规培养。细胞处于对数生长期，细胞密度达1.0×10<6>/mL时收获细胞。 经患者或者健康体健者同意，取骨髓或者外周血约2mL常规抗凝，分装成500μL于EP管中-80℃保存标本。 2、DNA的提取与检测 按美国Omega公司的E．Z．N．A Tissue DNA Kit提取试剂盒的步骤进行细胞或骨髓标本的DNA提取，获得的DNA样品分装后放入-30℃冰箱保存备用。获取的DNA样品在核酸蛋白分析仪上行浓度及纯度的检测。使用0.5﹪琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的完整性：将需要检测的DNA样品电泳，凝胶成像分析系统下观察DNA的质量。 3、限制性内切酶酶切消化 MspI、HpaII、EcoRII的反应体系均由1 μ g提取的基因组DNA与足够量相应的限制性内切酶及反应缓冲液等组成50μL的反应体系，37℃过夜酶切。BstN I的反应体系由1 μ g提取的基因组DNA与1μL限制性内切酶及反应缓冲液等组成50μL的反应体系，60℃过夜酶切。所有酶切后产物经加热灭活后行下一步实验。 4、引物设计 (1)、p53基因的引物设计本论文研究的p53基因CCGG的甲基化位点位于883位(GenBank sequenceno.X54156)，CCWGG位于756，858，和940(GenBank sequence no．X54156)。p53基因扩增引物根据文献资料，然后经过Primer5.0软件改进。最终设计引物如下：正义5’GGCGGATTACTTGCCCTTAC 3’；反义5’AGCCCGTGA CTCAGAGAGGAC3’ (2)、内参照β-actin基因的引物设计使用Primer 5.0软件对β-actin基因(NCBI登录号BC013835)进行酶切分析，先找出这四种限制性内切酶(Msp Ⅰ、Hpa Ⅱ、EcoR Ⅱ、BstN Ⅰ)均不能切开的序列。选取其中一段，然后对其进行引物设计。最终选择Tm值与目的基因相近、产物与目的基因相差至少lOObp的引物序列。正义为：5’GTCCACCGCAAATGCT TCTA 3’；反义：5’GC从TGCTATCACCTCCCCT 3’。 5、PCR扩增与产物鉴定 分别以酶切后产物(Msp Ⅰ、npa Ⅱ、EcoR Ⅱ、BstN Ⅰ)及基因组DNA为模板分别行目的片段及参照片段的PCR反应，产物电泳后在凝胶成像分析系统内观测电泳条带及摄像；部分标本的电泳条带经凝胶回收纯化后进行测序。 6、标本临床资料的处理 新收集的骨髓片或者血片经瑞氏染色后镜检，经确认为符合要求的标本后行进一步实验；所有标本的骨髓细胞形态学诊断由各医院的血液实验室完成；病人的其余临床资料通过病案室查取。 结果： 1、U937细胞的培养结果： 倒置荧光显微镜下观察，细胞生长密度达对数生长期；行细胞计数结果约为6×10<6>/个mL。 2、DNA的检测：所提取DNA标本经核酸蛋白分析仪检测符合要求(纯度：OD260/OD2801.7-2.0)；提取的急性白血病患者基因组DNA直接电泳，结果无散在片段，表明无降解。 3、PCR扩增与产物鉴定结果：分别以酶切后产物(Msp Ⅰ、Hpa Ⅱ、EcoR Ⅱ、BstN Ⅰ)及基因组DNA为模板进行PCR扩增，Msp Ⅰ、Hpa Ⅱ的酶切位点均为CCGG位点，但是Msp Ⅰ不受甲基化的影响，而Hpa Ⅱ受甲基化的影响，即如果CCGG位点存在甲基化，Msp Ⅰ酶切后产物为模板的PCR反应不能扩增出片段，而Hpa，Ⅱ酶切后产物为模板的PCR反应即可以扩增出片段；如果CCGG位点不存在甲基化，则两个反应均无扩增片段：同理，EcoR Ⅱ、BstN Ⅰ也是有相同的酶切位点CCWGG，结果分析同上。部分标本电泳后目的条带经凝胶回收后行产物测序，测序结果通过BLAST比对结果为符合要求扩增的片段：表明扩增产物即为所需扩增的p53基因的目的片段。 4、病例的临床资料 通过查询可能与急性白血病治疗效果相关或者预后相关的信息，包括年龄、性别，诊断分型，流式细胞学检查结果，初诊时患者白细胞计数、血红蛋白、血小板计数；是否伴有感染、出血；是否伴有其他脏器疾病；是否有肝脾淋巴结肿大的情况；2疗程标准化疗是否达到完全缓解等。 5、急性白血病患者p53基因甲基化检测结果 急性白血病患者p53基因第一启动子甲基化阳性率为38.7﹪，而急性淋巴细胞白血病与急性非淋巴细胞白血病患者分别为45.5﹪，35﹪。正常对照标本中未检测到p53基因的异常甲基化。 p53基因甲基化情况在急性白血病病人与正常人之间经过Fisher精确概率检验，p=0.0183<0.05，表明差别有统计学意义，即病人与正常人之间甲基化阳性数不同。急性淋巴细胞白血病与急性非淋巴细胞白血病患者之间经过Fisher。精确概率检验比较P=0.7054)0.05，差别无统计学意义，表明p53甲基化阳性率在ALL与ANLL之间无差别。 6、急性白血病患者p53基因甲基化与临床的关系 分析急性白血病患者p53基因甲基化与患者年龄、外周血白细胞计数、血红蛋白、血小板、是否伴有出血、感染、肝脾淋巴结是否肿大等之间的关系。其中，p53基因异常甲基化与肝脾是否肿大之间的关系经统计学计算P<0.05，表明有统计学意义。 结论： 1、部分急性白血病患者存在p53基因第一启动子异常甲基化，正常对照中未检测到p53基因的甲基化： 2、p53基因第一启动子在急性淋巴细胞白血病与急性非淋巴细胞白血病均可发生异常甲基化，两者之间发生甲基化的概率无统计学差异。 3、理论上揭示p53基因异常甲基化在急性白血病发病过程中可能有重要意义。 4、p53基因异常甲基化更常见于肝脾淋巴结肿大的患者，但p53基因异常甲基化与急性白血病治疗效果及预后的关系尚不能确定，须进一步研究以待确定。