论文部分内容阅读
婴儿眼球震颤综合征(Infantile Nystagmus Syndrome,INS)以前被称为先天性眼球震颤(Congenital Nystagmus,CN),是一种双眼共轭的不自主往复运动,通常在出生时或出生后几个月内发病。INS可分为特发性婴儿眼球震颤(Idiopathic Infantile Nystagmus,IIN)和感觉缺陷型眼球震颤(Sensory Defect Nystagmus,SDN)。IIN患者除了眼球运动异常之外不伴随其他临床可见眼部异常,而SDN患者通常伴随有视觉传入系统的异常,如无虹膜和先天性白内障等。SDN和IIN均可以表现为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X连锁遗传。到目前为止,通过连锁分析技术鉴定了7个IIN遗传位点,分别命名为NYS1~NYS7,并在NYS1和NYS6位点分别鉴定出致病基因FRMD7和GPR143。最近,通过全外显子组测序技术鉴定了一个新的IIN致病基因MANBA。SDN的致病基因则比较多,如PAX6突变导致常染色体显性遗传伴随虹膜发育不良和/或白内障的SDN。本课题收集并鉴定了四个INS家系,包括两个IIN家系和两个SDN家系。本研究运用基于微卫星标记的定位克隆和高通量的全外显子组测序等技术,对这四个INS家系进行分子遗传学分析,定位了一个新的IIN遗传位点9q33.1–q34.2,鉴定了两个INS家系的致病基因新突变,FRMD7突变c.973A>G(p.R325G)和PAX6突变c.1183+1G>A,报道了一个INS家系致病基因PAX6已知突变c.622C>T(p.R208W)引起的新表型。详细研究结果报道如下:1、一个新的特发性婴儿眼球震颤遗传位点的定位和候选致病基因分析一个来自宁夏回族自治区的常染色体显性遗传汉族眼球震颤家系NX-NYS共5代47人,11人表现为IIN,其中8名患者和15名正常人参与了本研究。先证者表现为婴儿期发病的水平摆动型眼球震颤,除视网膜电图和视觉诱发电位异常外,不伴随其它临床可见的眼睛和神经系统异常。家系内其他患者均在出生后6个月内表现出眼球震颤,其眼球震颤方式有跳动型、摆动型、旋转型和混合型。选取4个常染色体显性遗传IIN遗传位点NYS2(6p12)、NYS3(7p11.2)、NYS4(13q31-q33)、NYS7(1q31.3-q32.1)区间内和一个常染色体显性遗传IIN致病基因MANBA上下游的微卫星标记进行连锁分析,所有微卫星标记的两点LOD值均小于-2,排除了该家系致病基因与这4个IIN遗传位点和1个IIN致病基因的连锁。随后,通过全基因组中密度382个微卫星标记的连锁分析,将该家系的致病基因定位在9号染色体长臂微卫星标记D9S1776和D9S164之间大约18.3 Mb的区段(9q33.1–q34.2),其中4个微卫星标记的两点LOD值大于3。这是一个新的常染色体显性遗传IIN遗传位点,命名为NYS9,在定位区间内有202个编码蛋白质的基因。对区间内三个可能与眼球震颤疾病发生的候选基因LHX2、LHX6和NCS1进行突变检测,未发现任何致病突变。进一步对该家系先证者进行外显子组测序和生物信息学分析,目标区域的覆盖度为98.84%,平均测序深度为64.21 X。对定位区间内的11个变异进行Sanger测序验证,发现CCBL1基因c.412C>T(p.R138C)变异在家系内与眼球震颤表型共分离。系统进化分析发现CCBL1蛋白的R138残基在进化中不保守,CCBL1是否为该家系的致病基因还有待于进一步分析。2、一个特发性婴儿眼球震颤家系的FRMD7突变鉴定和功能研究一个来自湖北省的显性遗传IIN家系HB-NYS共5代38人,其中10人出生后不久即表现出眼球震颤,先证者伴随斜视、弱视和近视。该家系每代均有患者,但没有男性到男性的表型传递,有外显不全现象,符合FRMD7突变引起IIN的遗传方式。对先证者进行FRMD7直接测序,在第10外显子检测到c.973A>G(p.R325G)改变。对家系内其他成员进行Sanger测序,发现所有患者均携带c.973A>G改变,一名正常女性也携带这一改变,其他正常人均不携带这一改变。FRMD7蛋白R325残基在从斑马鱼到人等物种的进化中高度保守,表明该残基在FRMD7蛋白功能中发挥重要作用。激光共聚焦显微镜观察发现R325G突变不改变FRMD7的亚细胞定位,免疫共沉淀实验表明R325G突变并不影响FRMD7与已知互作蛋白CASK的结合,推测R325G突变可能是通过其它未知途径影响FRMD7蛋白功能。3、两个感觉缺陷型婴儿眼球震颤家系的精准基因诊断本研究收集并鉴定了两个来自河南省的显性遗传SDN家系HNXY-NYS和HNJZ-NYS。HNXY-NYS家系共4代7人,其中4人表现为婴儿期发病的眼球震颤。先证者临床表现为先天性水平眼球震颤,伴随虹膜发育不良,家系内其他患者与先证者临床表型相似。HNJZ-NYS家系共2代4人,其中2人在出生后6个月内即表现出眼球震颤。先证者表现为水平跳动型眼球震颤,其父亲临床症状与先证者类似,且伴有白内障。PAX6基因编码一个调控眼睛发育的关键转录因子,其杂合突变引起角膜、虹膜、晶状体、中心凹和视神经发育异常并伴随眼球震颤。这两个家系的患者均不能排除PAX6突变,故对其进行精准基因诊断。在HNXY-NYS家系先证者中检测到一个新的剪接突变c.1183+1G>A,该突变导致第12内含子的供体位点消失。对该突变进行基于微小基因的体外剪接发现c.1183+1G>A突变导致PAX6基因第12个外显子被剪切掉,引起第344位密码子之后的阅读框移码。同样地,对HNJZ-NYS家系先证者PAX6基因进行突变检测,在第8外显子鉴定出一个c.622C>T(p.R208W)变异,家系内其他患者同样携带该变异。R208W位于PAX6蛋白的连接结构域,在从水母到人等物种的进化中高度保守。R208W突变曾经被报道过两次,主要引起以无虹膜/虹膜发育不良为主要临床症状的遗传性眼病,本研究鉴定的R208W突变则引起以眼球震颤和白内障为主要临床表型的遗传性眼病,这一方面表明R208W是一个突变热点,另一方面也证实了PAX6基因突变具有较高的临床异质性。总之,在两个IIN家系和两个SDN家系中,通过定位克隆技术、外显子组测序技术以及致病基因突变分析技术,对INS的遗传方式和致病基因进行了初步研究,定位了一个新的IIN遗传位点,鉴定了两个已知INS致病基因的新突变并报道了一个已知INS致病突变引起的新表型。本研究进一步证实了INS具有广泛的遗传异质性和临床异质性,丰富了INS基因型与表型的关系。此外,本研究对理解INS的分子病理机制也具有重要的意义,并为INS的遗传咨询和精准基因诊断提供新的遗传学依据。