苜蓿夜蛾蜕皮激素受体及几丁质脱乙酰基酶基因的克隆与分析

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昆虫的蜕皮、变态和繁殖受到蜕皮激素的严格调控。蜕皮激素作用靶标由蜕皮激素受体(ecdysteroid receptor,EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle proteinU,USP)组成,蜕皮激素与EcR/USP作用启动蜕皮级联反应过程。研究昆虫蜕皮激素结构、功能和调控机理在开发环境友好型新药剂和基因调控开关等方面具有重要指导作用。本研究通过RT-PCR和RACE方法克隆得到苜蓿夜蛾EcR5’端序列。该基因片段的cDNA序列731个碱基,含有171个碱基的5’非编码区,编码156个氨基酸组成的多肽,分子量16.97 kDa,多肽的等电点为4.39。利用苜蓿夜蛾EcRcDNA推导的氨基酸序列在NCBI上用Blast软件进行搜索(高度同源选项),得到几种与其同源性较高的序列均为昆虫EcR的氨基酸序列,其中与甜菜夜蛾EU426551相应序列同源性高达94%,与草地贪夜蛾和斜纹夜蛾相应序列的同源性也达到93%,与另外2种夜蛾科昆虫烟芽夜蛾和棉铃虫的同源性达到88%,与鳞翅目的非夜蛾科的二化螟和家蚕的序列同源性稍低,但也达到了75%。序列同源性分析表明,本试验克隆得到的序列为苜蓿夜蛾蜕皮激素受体全长序列的一段。   几丁质(chitin)又称甲壳素、甲壳质等,是由N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)单体通过β-1,4糖苷键连接而成的直链高分子化合物。在自然界中,几丁质存在于真菌及藻类的细胞壁、无脊椎动物的外骨骼及表皮中,几丁质是自然界中最丰富的天然有机化合物之一,其数量仅次于纤维素。研究证明,几丁质是昆虫表皮和围食膜的重要组成成分,昆虫生长、发育的各个时期都需要一定量的几丁质。   几丁质脱乙酰基酶(chitin deacetylase,EC.3.5.1.41),简称CDA。CDA来源广泛,如真菌、酵母和昆虫等都发现CDA的存在,是几丁质降解酶系成员之一,能够催化几丁质中β-1,4糖苷键连接的N-乙酰基葡糖胺的乙酰胺基的水解。   本研究以苜蓿夜蛾5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到该虫CDA基因的cDNA序列。该序列含有1984个碱基,包括一个1626个碱基的开放阅读框,编码一个含541个氨基酸的蛋白,分子量约为61.86 kDa。克隆基因推导的氨基酸序列具有几丁质脱乙酰基酶典型的三个功能区,分别是几丁质结合区(47~103),催化区(199~355),低密度脂蛋白受体区(124~158)。序列比对表明,克隆的苜蓿夜蛾CDA与其他昆虫的CDA在核苷酸和氨基酸水平上的同源性存在较大差异。苜蓿夜蛾CDA的氨基酸序列与棉铃虫CDA(GQ411189)同源性达到98%,而与另外三种昆虫粉纹夜蛾CDA(AY966402)、蓓带夜蛾CDA(EU660852)和棉铃虫CDA(GQ411190\GQ411191EF600051)氨基酸序列间的同源性只有36-38%,属于两类CDA类群中的一类。基因的cDNA序列已经登录Genbank并获得登录号GU188855。
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