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嗜铬粒蛋白A（CGA）广泛分布于神经内分泌系统,因其半衰期长而成为评估整个神经内分泌系统活性的强有力指标。在扩张型心肌病中,交感神经兴奋性的长期低水平增强对于疾病进程具有激活作用:促进心肌细胞死亡、凋亡和刺激心肌间质胶原的增生重构,使心肌间质胶原增加、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原比例失调,从而使心肌细胞失去了坚韧的胶原支持而变形,左心室在功能上从压力泵转换为容量泵,心室球形化,最终导致心衰。现已发现在心血管系统中,CGA具有交感神经抵抗作用,并与慢性心衰症状的严重程度和预后密切相关;分子水平上CGA参与了对纤维母细胞的黏附和伸展作用,提示其与心肌重塑有关。然而CGA与心肌纤维化的作用目前未见报道。因此本实验拟观察CGA在扩张型心肌病表达的量与部位的变化,探讨CGA与心肌纤维化的关系,以进一步研究神经内分泌因素在DCM中的作用,从而为临床心肌纤维化的评估提供新的指标和思路。已知在人体中,CGA作为一个前体肽,在不同的组织中被分解为不同的分泌片段发挥其相应的作用。Catestatin(Human CGA352-372),是CGA家族中的一员,也是目前为止已知的CGA家族中唯一直接作用于烟碱受体而发挥作用的。同时作为强有力的内源性烟酸胆碱受体拮抗剂,抑制儿茶酚胺的释放,并具有负性肌力作用。那么抑制儿茶酚胺的释放和功能,是否对心肌细胞凋亡、成纤维细胞增殖和迁移有一定影响?目前为止尚未见有文献资料。本研究拟通过catestatin抑制儿茶酚胺的作用,观察心肌纤维化的发生,并进一步探讨catestatin影响心肌纤维化的可能机制。第一部分嗜铬粒蛋白A在扩张型心肌病中的表达目的观察扩张型心肌病（DCM）患者外周血及心肌组织中嗜铬粒蛋白A（CGA）的表达。方法收集DCM患者及正常健康志愿者外周血血清,用ELISA方法检测样本血清中CGA水平。取DCM心脏移植患者的废弃心肌组织样本,以及排除心脏疾病的脑外伤尸检心肌组织标本。利用RT-PCR技术检测心肌中嗜铬粒蛋白（CGA）的mRNA在DCM心肌和正常心肌中的表达变化;应用免疫组化鉴定心肌中CGA的分布位置及其表达强弱变化。结果ELISA显示DCM病人外周血中CGA为187.6±94.7ng/ml;正常健康志愿者外周血中CGA为130.6±21.1ng/ml（P＜0.05）。和正常对照心肌相比,RT-PCR证实DCM心肌组织中CGA-mRNA表达升高（P＜0.001）。免疫组化表明在DCM心肌中CGA颗粒粗大、部位密集,与正常心肌样本比较有统计学意义（P＜0.05）。结论:作为神经内分泌活性强有力指标的CGA在DCM心肌及外周血循环中表达均升高。第二部分扩张型心肌病中嗜铬粒蛋白A的表达与心肌纤维化的关系目的观察嗜铬粒蛋白A（CGA）在扩张型心肌病（DCM）中的表达、心肌纤维化程度及其二者间的关系,初步探讨CGA在心肌纤维化进程中的作用。方法取DCM心脏移植患者的心肌组织标本作为研究对象,排除心脏疾病的脑外伤尸检心肌组织标本作为对照。利用Real-time PCR方法检测心肌中嗜铬粒蛋白A（CGA）及Ⅰ型胶原纤维（COLⅠ）,Ⅲ型胶原纤维（COLⅢ）、基质金属蛋白酶（ADAMTS-1）的mRNA表达,并分析其相关性。免疫组化技术鉴定心肌中CGA的分布位置及其表达强弱变化;运用苦味酸天狼猩红特异染色和偏振光显微镜显像,并辅以图象分析软件计算心肌胶原容积积分（CVF）;并对CGA与心肌纤维化的相关性进行形态学上的比较。结果免疫组化表明,CGA在DCM心肌中表达增加（P＜0.05）。CVF证实DCM心肌中胶原容积积分较正常心肌增加（P＜0.001）。Real-time PCR证实心肌中CGA-mRNA与COLⅠ-mRNA、COLⅢ-mRNA、ADAMTS-1-mRNA三者均具有相关性,相关系数分别为0.729、0.95、0.665;形态学上,嗜铬粒蛋白A呈现阳性的部位及其分布密集区域的附近,心肌纤维化明显。结论DCM心肌中CGA的表达与心肌纤维化具有密切的相关性。由此可以推测DCM心肌组织中CGA的表达水平影响着心肌纤维化的发展。第三部分catestatin抑制心肌纤维化的机制探讨目的拟通过CGA活性片段catestatin抑制儿茶酚胺的作用,观察心肌纤维化的发生、发展,并进一步探讨catestatin影响心肌纤维化的可能机制。方法按照人catestatin序列(Human CGA352-372)合成此氨基酸序列,以HPLC分析其纯度。取1-3d的SD大鼠,在无菌条件下从心肌中利用差速贴壁法分离出心肌细胞和成纤维细胞。分别设立异丙肾上腺素（ISO）浓度组:10umol/L、20umol/L、40umol/L以及catestatin浓度组1umol/L、2umol/L、4umol/L、10umol/L、25umol/L。应用流式细胞技术（FACS）检测各组心肌细胞的凋亡率,以观察ISO对心肌细胞的损伤作用、以及catestatin是否对ISO刺激所造成的心肌损伤有修复治疗作用。利用细胞计数法（CCK-8）检测不同浓度的catestatin对成纤维细胞增殖的抑制作用;采用细胞划痕损伤实验检测不同浓度catestatin对成纤维细胞迁移的影响。结果经HPLC质谱分析证实,合成的catestatin纯度为99.21%。FACS检测显示:ISO梯度浓度损伤组中,在单纯使用不同浓度ISO刺激心肌细胞后,结果表明:随着ISO浓度升高、心肌细胞凋亡比率增加（P＜0.001）;catestatin治疗组中,预先使用ISO 20umol/L损伤细胞、后采用不同浓度的catestatin治疗,结果显示:5个不同浓度的catestatin均能降低ISO（20umol/L）诱导的心肌细胞凋亡（P＜0.05）,且该作用呈现浓度依赖性（P＜0.05）---即catestatin浓度越高,对ISO所造成的心肌细胞损伤的修复作用越明显,心肌细胞凋亡率越低。CCK-8检测发现:与正常对照组相比,低浓度的catestatin（1umol/L）作用于成纤维细胞24h后,即可导致成纤维细胞增值率下降,差别具有显著统计学意义（P＜0.001）;在catestatin浓度达到4umol/L以后,其抑制作用即可呈现平台期。划痕实验结果显示:与正常对照组相比,经过catestatin作用后,成纤维细胞向划痕内迁移的距离较对照组有所缩小;在catestatin浓度达到4umol/L以后,开始出现抑制成纤维细胞迁移的作用（P＜0.001）,随着catestatin剂量的增大,抑制作用越明显。结论catestatin能抑制ISO所致的心肌细胞凋亡、减缓成纤维细胞的增殖以及减慢成纤维细胞的迁移,其发挥作用均具有不同程度的catestatin浓度依赖性。由此我们推测catestatin对心肌纤维化的发生、发展具有抵抗作用,同时其浓度的高低也能影响着心肌纤维化的进程。