论文部分内容阅读
鸡球虫病由艾美尔球虫感染引起,给养禽业带来了巨额的经济损失。鸡球虫病的防治措施主要依赖药物和/或活疫苗,但由于耐药性、药物残留以及活苗毒力返强等潜在危害,研发新型预防球虫病的疫苗已逐渐成为研究热点。乳酸菌作为疫苗载体具有易培养、益生性以及免疫佐剂的特点。随着细菌表面展示系统的发展,外源蛋白在菌体表面以锚定表达得以实现。研究表明柔嫩艾美尔球虫（E.tenella）微线蛋白3（microneme protein 3,EtMIC3）具有良好免疫原性。EtMIC3具有7个串联的重复结构,包括A、B、C1、C2、C3、C4和D,其中A、B和D是三个不完全保守的重复结构,分别位于该蛋白的两端;C1、C2、C3和C4作为完全保守的区域位于该蛋白中间。本研究使用本室鉴定并保存的粪肠球菌（Entericoccus faecalis）分离株MDXEF-1为宿主菌,以表面展示的方式分别表达了EtMIC3蛋白的BC1和C4D结构域,并在表面锚定的基础上引入树突细胞靶向肽（DCpep）,旨在加强树突细胞的摄取和呈递作用,使机体产生更强的免疫应答及抗同源感染的免疫保护作用。首先构建重组阳性大肠杆菌BL21/pGEX-C4D,IPTG诱导后经SDS-PAGE分析,使用GST标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白,将GST-C4D融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用ELISA法检测兔源抗血清效价。Western blot方法检测制备的抗体与之前BL21/p ET30a-BC1中表达的BC1蛋白（BC1与C4D蛋白具有相同结构域C）反应的特异性。结果表明,制备的多克隆抗体的血清效价达到216,GST-C4D蛋白在BL21中表达,大小为53k Da。使用与C4D蛋白具有相同重复结构域的BC1蛋白进行Western blot可检测到41 k Da大小的特异性条带。将扩增的C4D和BC1片段克隆入乳酸菌表达载体p TX8048-SP-CWA中并引入树突细胞靶向肽DCpep,获得重组阳性质粒p TX8048-SP-BC1-CWA,p TX8048-SP-DC-BC1-CWA及p TX8048-SP-C4D-CWA,p TX8048-SP-DC-C4D-CWA,分别电转化入MDXEF-1宿主菌中获得4株重组粪肠球菌,分别简写为MDXEF-1/BC1-CWA、MDXEF-1/DC-BC1-CWA、MDXEF-1/C4D-CWA、MDXEF-1/DC-C4D-CWA。重组菌经Nisin诱导,使用上述制备的兔源C4D多克隆抗体和课题组保存的兔源BC1多克隆抗体,应用Western blot和细菌间接免疫荧光法检测外源蛋白在细菌表面表达。结果表明,融合或非融合DCpep的BC1或C4D蛋白均可在重组粪肠球菌的表面表达。之后采用Nisin诱导上述4株重组粪肠球菌和空质粒对照粪肠球菌MDXEF-1,调整细菌浓度至1×1011CFU/m L,对7日龄的雏鸡进行免疫,每只鸡每日口服免疫一次,每次100μL(1.0×1010 CFU)菌液,连免三天,共免疫三次,每次间隔2周;PBS对照和攻虫对照组口服100μL PBS（p H7.2）。在每次免疫后14天制备各组鸡血清、盲肠冲洗液,采取脾脏组织。采用间接ELISA法检测血清IgG和冲洗液s Ig A抗体水平;实时荧光定量PCR（q RT-PCR）方法检测脾脏细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-6和IL-17的m RNA表达量。三免后两周取各组鸡外周血制备淋巴细胞悬液,CCK8试剂盒检测淋巴细胞增殖情况。结果表明,4株重组菌组均能诱导机体产生显著升高的特异性血清IgG和s Ig A,脾脏细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-6和IL-17的表达水平亦显著升高,且随着免疫次数的增加表达水平逐渐升高,其中融合表达DCpep的重组菌组抗体水平明显更高于非融合表达菌组（p＜0.05）,表达BC1蛋白的重组菌诱导免疫应答水平显著高于表达C4D蛋白的重组菌（p＜0.05）。三免后,4株重组菌免疫组的外周血淋巴细胞增殖能力显著高于PBS组和MDXEF-1组,且融合表达DCpep重组菌组的增殖能力显著高于非融合表达菌组（p＜0.05）。在三免后一周进行攻虫实验以评估免疫保护效果,除PBS组外,将各组鸡灌服4×10~4个E.tenella孢子化卵囊,感染7天后扑杀。通过平均增重、卵囊排出率、病变评分、抗球虫指数、病理组织切片观察以及盲肠组织炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达水平来评估免疫保护效果。结果表明,4株重组菌组与攻虫对照组相比,增重率升高、卵囊减少率增加、病变减轻,其中以MDXEF-1/DC-BC1-CWA组的各项指标最佳。MDXEF-1/C4D-CWA、MDXEF-1/DC-C4D-CWA、MDXEF-1/BC1-CWA、MDXEF-1/DC-BC1-CWA4个免疫组的抗球虫指数（ACI）依次为161.69、172.68、171.47和178.41;攻虫后各组盲肠的病理学眼观及组织学变化,4株重组菌相对于对照组病变较轻,以MDXEF-1/DC-BC1-CWA组的病变最轻微;4株重组表达菌的炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达水平均显著低于PBS攻虫对照组（p＜0.01）,其中融合表达DCpep的重组菌组各因子表达水平显著低于非融合表达组（p＜0.01）,且表达BC1蛋白重组菌组的各因子表达水平显著低于表达C4D蛋白重组菌组（p＜0.01）。综上,在粪肠球菌表面展示融合或非融合DCpep的EtMIC3蛋白BC1或C4D结构域均可刺激机体产生特异性免疫应答,对同源感染提供部分免疫保护作用,本研究为基于EtMIC3蛋白的乳酸菌疫苗研究提供了参考。