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目的:邻苯二甲酸二丁酯(DBP)孕晚期染毒干预泄殖腔发育导致尿道下裂和肛门闭锁的发生以及全身多脏器的发育不良。本课题重点探讨DBP影响生殖系统与生长发育的毒理机制。方法:建立DBP诱导的尿道下裂和肛门闭锁动物模型。统计DBP染毒后雄性子鼠尿道下裂和肛门闭锁的发生率,测定畸形子鼠的体重(BW)、肛门生殖器距离(AGD),实质性脏器的发育指数(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏),评估发育情况。同时评估DBP孕期染毒对母鼠的危害性。在尿道下裂动物模型中,用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测尿道下裂、染毒未畸形和正常雄性子鼠生殖结节中音猬因子(Shh)、骨形态发生蛋白4(Bmp4)和成纤维细胞成长因子8(Fgf8)、成纤维细胞成长因子10(Fgf10)、成纤维细胞成长因子受体2(Fgfr2)的表达。同时检测这些子鼠睾丸中雄激素受体(AR)和睾酮生成关键酶基因如细胞色素P450 11A1(Cyp11a1)、滋养层细胞抗原3b(Hsd3b)、B类清道夫受体1(Scarb1)、类固醇激素合成急性调节蛋白(Star)、类固醇5α还原酶2(Srd5α2)的表达。并且进一步利用Affymetrix 3’IVT表达谱芯片检测尿道下裂和正常对照雄性子鼠生殖结节中基因谱的表达差异。分别选取5个表达上调和下调的基因,进行实时定量PCR的验证,证实DBP染毒致尿道下裂和正常对照雄性子鼠生殖结节的Affymetrix 3’IVT表达谱芯片结果的正确性和可信性。在肛门闭锁动物模型中,用Real-time PCR检测末端直肠中Shh、Bmp4、Fgf8、Fgf10、Fgfr2的表达。并进一步用Real-time PCR、免疫组织化学和蛋白质印迹法(Western Blot)检测末端直肠中AR、Fgf10/Fgfr2的表达情况。同时对肛门闭锁子鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织中AR、Fgf10/Fgfr2的m RNA和蛋白的表达情况进行相应的检测。结果:(1)DBP孕晚期染毒能建立稳定的,可重复的、高致畸率的尿道下裂和肛门闭锁动物模型。发生率分别是尿道下裂为42.1%,肛门闭锁为39.5%。孕期DBP染毒能引起母鼠体重下降,孕期延长,新生鼠数量减少。尿道下裂和肛门闭锁雄性子鼠的BW和AGD和对照组相比明显降低。同时染毒组的子鼠重要脏器(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏)的脏器发育指数与对照组相比明显降低。病理学检测发现了尿道下裂子鼠生殖结节尿道开口明显在尿道轴的腹侧,肛门闭锁子鼠末端直肠的盲端改变。DBP染毒后,畸形子鼠的血清雄激素水平明显降低。(2)在尿道下裂动物模型中我们发现通过在尿道下裂子鼠、染毒未畸形子鼠、对照组子鼠的比较,我们发现在染毒未畸形子鼠的睾丸中,AR和Srd5α2和正常组相比没有出现明显的降低。而其他的检测指标,在睾丸中AR、P450 11A1、Hsd3β、Scarb1、Star和在生殖结节中Shh、Bmp4、Fgf8、Fgf10、以及Fgfr2在尿道下裂子鼠、染毒未畸形子鼠中和正常组相比均有明显的降低。进一步的在对尿道下裂子鼠生殖结节和对照组子鼠生殖结节中Affymetrix 3’IVT表达谱芯片检测后,共筛选出163个差异表达的基因,其中表达上调的基因为57个,而表达下调的基因则为106个。实时定量PCR结果显示,所选取的10个基因的表达水平均与Affymetrix 3’IVT表达谱芯片结果一致,由此证实了DBP染毒致尿道下裂和正常对照雄性子鼠生殖结节的Affymetrix 3’IVT表达谱芯片结果的正确性和可信性。通过对DBP染毒致尿道下裂和正常对照雄性子鼠生殖结节的Affymetrix 3’IVT表达谱芯片的差异基因进行GO富集分析,我们发现差异基因中显著富集的Go条目主要和胚胎发育、脏器形成、激素代谢、细胞连接、细胞增殖、钙离子代谢等方面密切相关。通过对DBP染毒致尿道下裂和正常对照雄性子鼠生殖结节的Affymetrix 3’IVT表达谱芯片的差异基因进行KEGG富集分析,我们则发现差异基因中显著富集的KEGG信号通路主要和细胞紧密连接、物质代谢、细胞凋亡等方面密切相关。(3)在肛门闭锁动物模型中,我们发现随着AR表达的降低,Fgf10/Fgfr2的m RNA水平和蛋白水平明显降低。DBP染毒致肛门闭锁雄性子鼠的末段直肠组织中Shh、Bmp4、Fgf8、Fgf10、以及Fgfr2基因的表达水平明显低于正常对照组。(4)对肛门闭锁子鼠的重要脏器的检测中我们发现在肾脏、脾脏、肝脏和心脏Fgf10/Fgfr2的表达明显降低,而AR仅在肾脏中表达明显降低。结论:DBP孕期染毒不仅仅对子鼠有致畸作用,对母体也有较大的危害性。尿道下裂生殖结节和肛门闭锁末端直肠中在DBP影响后的相似基因的表达趋势提示我们,DBP的作用靶点可能是尿道和直肠分化前的胎儿器官-泄殖腔。DBP可能是干预了泄殖腔的发育最终引起了尿道和肛门直肠畸形的发生。DBP干预雄激素以及其相关信号通路在泄殖腔的发育过程中起着至关重要的作用。在染毒未畸形子鼠生殖结中相对表达正常的AR和Srd5α2基因能成为我们寻找减轻DBP致畸毒性的重要线索。DBP还可能通过影响细胞紧密连接、物质代谢、细胞凋亡的多方面的因素引起畸形的发生。并且在脏器的发育过程中,除了雄激素相关的信号通路外,还存在其他非雄激素依赖的信号通路,同样可能受到了DBP的干预,最终导致了多脏器发育不良。DBP生殖与发育毒性机制的研究将会是一个复杂的过程,阐明相关的发生机理将会对我们寻找有效的干预措施,降低新生儿畸形的发生率提供重要的线索。