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背景和目的:肺癌是近年来发病率和死亡率明显增高,对人群健康和生命威胁最大的常见恶性肿瘤之一,占全世界癌症相关死亡的首位。其中非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌总数的80%～85%,尽管近年来肺癌的治疗有了长足的进步,但由于大多数非小细胞肺癌患者在诊断初期已存在转移,因此治疗效果差,预后不佳,严重威胁着人类的生命健康。对非小细胞肺癌发生发展的分子机制的深入研究有助于提供新的诊断和治疗思路,从而提高患者生活质量,延长生命。肺癌发生发展的过程中,除与环境、遗传因素密不可分,癌基因激活或抑癌基因的失活起着非常重要的作用。近年的研究表明,抑癌基因LKB1(liver kinase B1)在全身多种肿瘤细胞中发生突变,在大多数散发肿瘤中,LKB1的突变是罕见的,但在非小细胞肺癌中LKB1突变率很高,可达20-30%。LKB1通过下游激酶在调节细胞能量代谢、细胞增殖、细胞周期和细胞极性等方面发挥重要作用。其下游效应分子AMPK(AMP-regulated protein kinase)是LKB1重要的靶蛋白之一,在调节细胞能量代谢方面起着重要的作用。LKB1/AMPK信号可以抑制m TOR信号通路从而抑制肿瘤细胞生长。而当LKB1失活后可以通过多种通路促进肺癌的发生发展。PI3K/Akt信号转导通路是肿瘤细胞中最常见的调节异常通路之一,其参与调节细胞增殖、凋亡,并与肿瘤的血管形成和侵袭转移有关。Akt下游的FOXO3a抑癌转录因子广泛存在于人体各组织,并在调控细胞增殖分化、细胞凋亡以及调节免疫等方面发挥着重要作用。当FOXO3a发生磷酸化时,会与14-3-3蛋白结合,从细胞核转运至细胞质,从而抑制其作为转录因子的活性。由不同机制导致的抑癌转录因子FOXO3a功能的失活都可能会促进细胞增殖调控的紊乱、细胞损伤的累积,从而导致肿瘤等疾病的发生。前期工作对LKB1和PI3K/Akt信号转导通路的研究中我们发现,Akt的激活可以使LKB1野生型细胞系中FOXO3a Thr32位的磷酸化水平升高;而在LKB1突变型细胞系则不会发生。提示LKB1可能参与对Akt下游的FOXO3a的磷酸化调控。在前期研究的基础上,本研究首先在LKB1基因状态不同的NSCLC细胞系中探讨LKB1对FOXO3a的调节作用;其次,构建稳定表达LKB1sh RNA的同源细胞系,并在该细胞系中探讨LKB1基因敲除后对于FOXO3a的磷酸化及其靶基因的影响;最后进一步探讨LKB1是否通过其下游激酶AMPK发挥对FOXO3a的调控作用,为揭示肿瘤的发生发展提供理论基础。方法:(1)分别将p EGFP-C2、LKB1野生型质粒和LKB1-K78M(KD,kinase-deficent)质粒转染至LKB1突变型和野生型NSCLC细胞系中,48小时后检测p-FOXO3a的表达变化。(2)采用慢病毒载体系统将靶基因LKB1sh RNA转入H1299细胞中,构建LKB1稳定抑制的同源细胞系H1299-LKB1sh RNA/H1299-PLKO.1,并通过荧光定量PCR、Western Blot在m RNA和蛋白水平检测构建细胞系中LKB1的表达情况。然后通过Western Blot对两种细胞系中P-FOXO3a磷酸化水平以及FOXO3a的靶基因Bim1进行检测。(3)最后,我们用AMPK特异性激活剂A-769662处理NSCLC细胞,检测P-FOXO3的表达水平的变化。结果:(1)对比转染空白对照质粒p EGFP-C2和无激酶活性的LKB1-K78M质粒的细胞,在多种LKB1突变型及野生型的NSCLC细胞系中转染LKB1质粒使LKB1过表达后,可上调P-FOXO3a的表达。(2)荧光定量PCR及Western Blot结果显示与对照细胞株H1299-PLO.1相比H1299-LKB1sh RNA中LKB1在m RNA水平和蛋白水平的表达水平明显降低,说明构建同源细胞系成功。LKB1 knockdown后,H1299细胞内P-FOXO3a的表达较对照细胞系H1299-PLK0.1下降,FOXO3a的靶基因Bim1表达水平上升。(3)AMPK特异性激活剂A-769662处理后的H1299细胞与对照相比,P-FOXO3的磷酸化水平升高。结论:(1)LKB1突变和野生型NSCLC细胞系中,LKB1过表达均可使FOXO3a的磷酸化水平升高,且此过程与其激酶活性有关。(2)LKB1基因稳定knockdown的细胞系中,P-FOXO3a水平明显下降,而其靶基因Bim-1的表达水平上升。(3)LKB1可能通过激活下游效应分子AMK从而发挥对FOXO3a的调控作用。