Fas/Fas L信号通路最早被证明在细胞凋亡中起着重要的作用。Fas结合Fas L或Fas抗体后激活细胞凋亡，然后通过其死亡结构域(DD)和FADD的死亡结构域(DD)相互作用，从而招募FADD至细胞膜上。FADD～通过其与caspase-8共有的死亡效应结构域　(DED)　招募caspase-8，造成casepase-8的活化和其后的casepase级联反应，最终导致细胞的凋亡。FLIP具有和caspase-8类似的DED结构域，但没有caspase-8的蛋白酶活性，因此可以通过竞争性地结合FADD阻断caspase-8的招募和活化，从而抑制凋亡过程。近年来的研究表明，Fas/Fas L信号通路及其下游信号分子，包括FADD、casepase-8并FLIP等，不仅仅参与细胞凋亡，还参与细胞的增殖。本实验室近年来一直集中研究TNF受体家族、其下游衔接分子FADD、Caspase 8以及Caspase 8的竞争抑制蛋白质FLIP促进细胞增殖的作用及其信号传导途径。为了进一步阐明Fas/Fas L信号通路和这些分子在细胞凋亡和增殖中作用，我们通过以下两种方式进行了研究。 　一、利用转基因小鼠模型研究Fas L与FADD信号通路在T细胞发育中的协同作用 在本研究中，我们将Fas L点突变的gld小鼠与转FADD及其变体基因的小鼠交配多轮后得到gld/gld TgFADD、gld/gld　FgFADD-S191A和gld/gld　TgFADD-S191D的小鼠。这些不同基因型的小鼠的免疫系统表现出了与gld/gld小鼠不同的一系列症状和表型，尤其是gld/gld TgFADD-S191A小鼠，其胸腺的发育和分化加快，胸腺的大小和细胞总数增加；外周淋巴系统，如淋巴结和脾脏，也表现出比gld/gld小鼠更明显的肿大现象。而与之相反，gld/gld　TgFADD-S191D小鼠的胸腺的发育和分化受到抑 制，外周的淋巴结和脾脏肿大症状都得到了很大程度的缓解。我们采用T细胞发育和分化过程中不同时期的表面分子抗体标记这些小鼠的胸腺和外周淋巴细胞，并用FACS进行了分析，对这些小鼠进行了详细的表型描述；同时我们也分析比较了这些细胞在增殖和凋亡刺激下的细胞生物学行为，比较了胸腺细胞和淋巴结细胞在接受增殖刺激后的NF—к B、SP1和AP1等转录因子的变化，试图从机理上解释这些小鼠的表型。 我们的结果表明：在gld/gld小鼠的遗传背景下，除了FADD—S191D的过量表达会导致出现以往文献报道的相似表型外，FADD—A的过量表达则表现出促进胸腺早期T系前体细胞增殖和分化的作用，从而引起了gld/gld TgFADD—S191A小鼠胸腺利外周免疫器官的一系列表型变化。我们实验室在前期研究中证明FADD永久磷酸化形式对T细胞的发育和增殖具有抑制作用，由于磷酸化和非磷酸化是一个动态平衡，FADD非磷酸化形式在T细胞发育和增殖中的作用又是怎样呢?我们的以上结果是在国际上第一次报道FADD—S191A具有促进细胞增殖和细胞周期的作用，使得FADD通过磷酸化修饰调控T细胞发育、增殖和细胞周期这一假说显得更加丰满和令人信服。同时，这些结果也暗示了Fas/Fas L信号通路可能通过调节细胞凋亡参与了胸腺的早期发育。 二、利用c—FLIP作为钓饵蛋白进行酵母双杂交筛选以及相关的功能研究 我们利用c—FLIP(L)作为钓饵蛋白，通过酵母双杂交的方法对两个文库进行筛选，得到了几个有意义的蛋白，其中之一就是Ro52蛋白。接着我们在哺乳动物细胞中通过免疫共沉淀的方法对两者的相互作用进行了进一步的验证。同时，通过构建c—FLIP(L)的不同变体，我们确定了FLIP与Ro52相互作用的结构域是其蛋白N—端的DEDs。进一步的研究表明，FLIP与Ro52相互作用具有以下的几个功能： 1、在哺乳动物细胞293T中研究FLIP与Ro52两者相互作用时，我们发现Ro52的表达会引起FLIP蛋白的泛素化水平增加，从而导致FLIP的降解而下调其水平。由于FLIP在某些肿瘤细胞，如B16F10和HeLa细胞中高表达而造成这些细胞对凋亡刺激不敏感，因此我们试图通过过量表达Ro52来降低FLIP水平，然后检测细胞对凋亡刺激的敏感性。我们的结果表明，Ro52的过量表达确实降低了肿瘤细胞内的内源性FLIP的蛋白量，并且使得原本对死亡受体介导的凋亡不敏感的肿瘤细胞变得敏感。当然，Ro52和FLIP的结合阻断了FLIP与接头蛋白如FADD或TRADD等的结合，从而解除了对凋亡通路的抑制，也可能在这个过程中起到了一定的作用。 2、另外，无论FLIP参与凋亡抑制还是NF—кB信号通路的激活，都需要其DED结构域平HFADD蛋白相瓦作用，因此Ro52和FLIP的DED的结合可能会导致FLIP参与的凋亡抑制或NF—кB信号通路激活的阻断。我们的结果也证实了这些假设：体外的His—pulldown实验表明，Ro52蛋白的加入可以明显的阻断FLIP与His—FADD蛋白的结合。利用293T细胞进行NF-кB启动子控制下的luciferase分析也表明：Ro52蛋白的过量表达确实显著地抑制了FLIP蛋白对NF-кB的激活作用。这种抑制效果有时即便在FLIP的蛋白量没有明显降低的情况下依然存在，表明Ro52可能通过两种方式来调控FLIP参与的NF-кB信号通路激活：1)通过泛素化降解降低FLIP蛋白量；2)结合于FLIP的DEDs，阻断FLIP与FADD蛋白的结合，从而阻断整个激活通路的开启。 3、已有的研究表明，UV照射也可以提高肿瘤细胞的凋亡。虽然UV照射涉及的凋亡通路比较复杂，但是通过降低FLIP的水平从而使得肿瘤细胞对死亡受体介导的凋亡敏感是其中一条途径。我们的实验表明，UV照射可以在很短时间内上调Ro52的mRNA水平，处理一段时间以后Ro52的蛋白水平也会升高，而与之相对应的是FLIP蛋白水平的降低和细胞凋亡率的上升。IP的结果也表明在UV照射后，内源性Ro52和FLIP的结合加强，说明Ro52通过加强与FLIP的结合提高FLIP的泛素化水平，从而引起FLIP的降解并开启凋亡通路。 4、为了验证Ro52与FLIP相互作用的功能的特异性，我们设计了针对Ro52的RNA干扰。RNA干扰的结果表明，原先Ro52过量表达引起的FLIP的降解、肿瘤细胞的凋亡率增加以及NF—кB信号通路激活的阻断都被Ro52的RNA干扰所扭转。证明Ro52引起的这些效应都是特异性的。 因此，我们发现了一种新的和FLIP相互作用的蛋白Ro52，它通过与FLIP的结合和泛素化降解FLIP调控FLIP所参与的生物学过程，包括对细胞凋亡通路的调控和NF—кB信号通路的调控等。这些发现可以帮助我们更好地了解FLIP和Ro52在细胞凋亡和增殖中的功能及其调控机制，同时也对Ro52蛋白本身在自身免疫疾病发生中的作用提供了一种新的解释。 综上所述，通过上述的两个研究，我们进一步深入了解了Fas/Fas L信号通路及其下游信号分子FADD和FLIP在细胞增殖和凋亡中的作用。这对阐明细胞增殖，尤其是T细胞增殖的启动和调控有着比较重要的理论意义。