论文部分内容阅读
目的:研究体外扩增的自然杀伤细胞(NK)及CIK细胞(CIK)在联合西妥昔单抗(cetuximab)后对人EGFR阳性的结直肠癌细胞株DLD-1及Caco-2的杀伤效应,以及呼肠孤病毒(reovirus)能否进一步增强CIK及NK细胞与cetuximab的联合抗肿瘤效应,为临床结直肠癌的治疗提供新的治疗策略。方法:从健康献血者的外周血分离出单个核细胞(PBMC),分别常规诱导出CIK细胞及NK细胞,收集培养第14天的CIK细胞及NK细胞,ELISA实验检测CIK细胞培养上清中IFN-γ及TGF-β的水平,通过流式细胞分析仪分析CIK细胞及NK表型及结直肠癌细胞DLD-1和Caco-2的EGFR受体的表达水平。分别采用RTCA(RTCA)及乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测NK细胞的细胞毒作用。利用TCID50法和甲基纤维素改良的噬斑实验测定reovirus病毒的滴度,使用不同滴度的reovirus病毒感染CIK细胞及NK细胞。采用实时无标记分析仪分别动态监测CIK及NK细胞在不同滴度reovirus感染后联合cetuximab对DLD-1及Caco-2细胞株的杀伤效应。结果:流式细胞仪检测CIK细胞亚群可见培养后CD8+T(67.5±16.5%)、CD3+CD56+NKT(20.1±13.7%)及CD16+CD56+NK细胞比例(7.0±6.6%)均较培养前CD8+T(26.7±9.5%)、CD3+CD56+NKT(3.1±1.8%)及CD16+CD56+NK(2.6±2.7%)显著增高;CIK细胞培养培养上清中细胞因子浓度IFN-γ水平由34.8±35.4 ng/L增高到2041.8±697.9ng/L(P<0.01),而同时TGF-β的水平由1293.8±633.9ng/L降为116.7±26.8ng/L(P<0.01);经过14天体外扩增培养的NK细胞纯度可达86.2%;DLD-1及Caco-2肿瘤细胞表面均高表达EGFR,分别为81.6%及82.9%;LDH释放实验结果与RTCA检测所显示的杀伤趋势基本一致;TCID50法及噬斑实验求得病毒滴度分别为2.53×109pfu/L及1.36×109 pfu/L。RTCA检测发现NK细胞联合西妥昔单抗对结直肠癌细胞株杀伤作用明显高于单一的NK细胞组;CIK细胞对DLD-1及Caco-2细胞株的杀伤率分别为16.04±0.87%及27.67±3.10%,而当联合使用cetuximab后杀伤率分别增高到31.56±3.55%及35.96±1.73%,且用10pfu和100pfu滴度reovirus病毒感染CIK细胞及NK细胞后联合cetuximab对肿瘤细胞杀伤效应更明显。结论:CIK细胞及NK细胞联合cetuximab的杀伤效果明显增强,对KRAS野生型DLD-1细胞及KRAS突变型Caco-2细胞均有效,reovirus能进一步增强CIK细胞和NK细胞与cetuximab的联合抗肿瘤效应,为今后的临床研究奠定实验基础。