背景和目的食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。对食管癌和其它癌症寻求预防和治疗途径，减少癌症对人类健康的威胁是一项重要的工作。植物化学物为植物性食品中天然存在、含量较少的一类具有抗氧化、抗癌、减少脂质过氧化和降低胆固醇等生理活性的化学物质。寻找植物中抗癌成份进行食管癌的预防及治疗具有十分重要的意义。流行病学研究表明蔬菜水果的消费与降低心血管疾病以及某些癌症的危险有关。水果和蔬菜中的植物化学物尤其是酚类作为主要的生物活性物质，在对健康的保护方面起着重要作用。类黄酮属于多酚类化合物家族，广泛存在于水果、蔬菜、茶叶等各类植物之中，具有较强的抗氧化、抗过敏、消炎、抑菌、抑制肿瘤生长等作用。近年来一些调查结果表明，人类每天从膳食中摄入相当数量的类黄酮，其摄入量甚至超过了一些微量营养素。苹果中富含植物化学物如类黄酮及多酚类，实验室研究显示苹果提取物具有很强的抗氧化活性，可以减少脂质过氧化，降低胆固醇以及抑制结肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞的生长，动物实验研究表明苹果提取物可以预防乳腺肿瘤的发生。虽然流行病学研究结果提示苹果的消费与降低肿瘤的危险性有关，一些体外和动物体内实验结果表明苹果提取物对某些肿瘤具有抑制作用，但对其复杂多样的作用机制还不甚了解，需进行深入的研究加以阐明。叶黄素（lutein）属于类胡萝卜素，流行病学研究表明，在预防视黄斑退化、肿瘤的发生与发展、心血管疾病和增强机体免疫力等方面有着广泛的生物学活性。水果蔬菜中天然存在的植物化合物的联合作用在抗氧化以及肿瘤预防方面至关重要。通过苹果中类黄酮物质含量的检测以及探讨苹果提取物和叶黄素抗肿瘤细胞增殖、诱导凋亡，以及作用于肿瘤细胞后在基因和蛋白水平发生的变化，对于揭示水果蔬菜预防肿瘤的作用机制以及开发研制复合型保健品具有重要的理论和实际意义。由于食管癌是严重危害人体健康的恶性肿瘤，寻找对其干预和治疗的措施非常重要。流行病学研究表明蔬菜和水果的消费与肿瘤发病呈负相关，但其作用机制尚未阐明。苹果中含有丰富的类黄酮，为了解苹果中类黄酮的含量水平、苹果提取物和叶黄素的抗肿瘤效应以及作用机制，以期为食管癌的膳食预防和肿瘤的辅助治疗提供参考。本课题选用苹果提取物和叶黄素作为处理因素，利用食管癌细胞建造体外模型，采用MTT法、流式细胞仪、免疫组织化学、western blot、DDRT-PCR和蛋白质组学等技术，从苹果提取物含量化学分析入手，以细胞增殖和凋亡事件为切入点，对细胞周期，凋亡诱导，差异基因乃至差异蛋白表达情况进行系统的研究，对苹果提取物和叶黄素抗食管癌作用及其机制进行深入探讨，同时筛选其作用的靶分子，为食管癌的预防及低毒抗癌药物的研制提供理论依据。方法全文共分五个部分，主要研究方法及内容如下：第一部分苹果提取物的制备和检测。采用溶剂提取法从苹果样本中提取可溶性黄酮类物质制备苹果提取物，铝离子显色法检测其中的总黄酮含量。第二部分苹果提取物与叶黄素对食管癌细胞周期和分化的影响。用不同浓度的苹果提取物和叶黄素处理EC9706细胞，采用MTT法，观察对细胞增殖抑制的影响。流式细胞术检测细胞周期分布，免疫组织化学的方法检测周期调节蛋白cyclin D1表达情况。第三部分苹果提取物与叶黄素对食管癌细胞凋亡的影响。用不同浓度的苹果提取物和叶黄素处理EC9706细胞，采用流式细胞术和原位细胞凋亡检测技术，观察对细胞凋亡的影响，免疫组织化学方法和Western印迹杂交技术检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达情况。第四部分苹果提取物对食管癌细胞作用的差异基因表达。采用荧光标记mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）对处理组和对照组差异基因表达谱进行比较，筛选差异表达基因并进行克隆与测序鉴定。以探讨苹果提取物对食管癌细胞作用后基因水平的分子变化。第五部分蛋白质组学方法筛选标志物。以苹果提取物作用于体外培养的人食管癌EC9706细胞为模型，采用双向凝胶电泳和质谱技术筛选作用后在食管癌细胞中表达的差异蛋白质，旨在为阐明苹果提取物对食管癌细胞的作用及其抗癌的分子机制，以及为进一步探讨肿瘤治疗标志物提供依据。结果1．对9种新鲜水果提取物总黄酮检测表明，总黄酮的含量范围为40.11mg／100g～122.88mg／100g。由高到低依次为：红富士苹果、沙梨、黄金梨、香梨、丰水梨、红橙、砀山梨、水晶梨和猕猴桃。2．在体外实验条件下苹果提取物和叶黄素均显示出抑制食管癌EC9706细胞增殖的作用。苹果提取物通过抑制细胞DNA合成，降低了细胞周期中S期百分率，使细胞停滞于G₂／M期，叶黄素则使细胞停滞于G₀／G₁期，并抑制了Cyclin D1的表达。叶黄素作用后使食管癌增殖型细胞减少，分化型细胞增多，诱导了良性分化。3．苹果提取物和叶黄素均可诱导EC9706细胞凋亡，同步分析凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达结果显示，苹果提取物和叶黄素可下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达及上调促凋亡蛋白Bax的表达。4．采用DDRT-PCR技术对苹果提取物作用于食管癌细胞后的差异表达基因进行检测，获得了差异表达指纹图谱，经克隆和测序获得了差异表达片段的基因序列。这些差异表达的基因序列主要涉及SET结构域和PDZ结构域、细胞周期生长调节、参与细胞有丝分裂的肿瘤蛋白D52以及与肿瘤发生有关的甲硫氨酸腺苷基转移酶Ⅱ。5．采用蛋白质组学技术检测苹果提取物作用后的差异表达蛋白，获得了差异表达蛋白的双向凝胶电泳图谱，用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MOLDI-TOF-MS）鉴定了18个差异蛋白的肽指纹图谱，经数据库检索匹配，筛选出了一些相关蛋白，分析发现这些蛋白功能涉及细胞代谢、信号转导、细胞骨架组成、氧化应激、免疫、细胞增殖和凋亡以及分子伴侣等方面。这些生物标志物主要有：微管去稳蛋白、微管蛋白伴侣分子、蛋白激酶C抑制剂、泛素、HMG B1、异质性核内核糖核蛋白、微管蛋白分子伴侣和醛缩酶A。结论1．所检测的9种水果中均存在黄酮类化合物，但在不同种类的水果中差别较明显。与其它水果相比苹果总黄酮含量较高，是膳食黄酮类化合物的重要来源。2．苹果提取物和叶黄素在一定浓度范围内均可抑制食管癌EC9706细胞增殖，表明具有抗癌作用。干扰食管癌细胞周期，降低分裂期细胞可能是其抗癌机制之一。对细胞周期关键蛋白Cyclin D1表达水平的检测表明，经叶黄素作用后，其表达水平降低，揭示叶黄素通过调节Cyclin D1表达，调控细胞周期的进程，进而使食管癌EC9706细胞阻滞于G₀／G₁期，可能是叶黄素抑制食管癌细胞增殖的另一重要机制。叶黄素还具有促进细胞分化潜能，有助于延缓细胞生长，降低恶性程度。3．苹果提取物和叶黄素抑制EC9706细胞增殖的作用伴随着对凋亡的诱导和细胞循环周期的阻滞，研究结果提示苹果提取物和叶黄素通过介导Bax和Bcl-2的表达诱导细胞凋亡过程的发生，是其诱导食管癌细胞凋亡的分子机制之一。4．DDRT-PCR分析表明，差异表达的基因序列主要涉及SET结构域、PDZ结构域，揭示了苹果提取物在基因水平上的影响涉及到跨膜受体或离子通道蛋白，与细胞内信号调节以及蛋白质间相互作用有关的结构域。进而可影响到蛋白质定位、信号转导和蛋白复合体的组装等方面。从基因水平进一步深入探讨了苹果提取物的抗癌作用机制。研究中发现苹果提取物作用后，可使食管癌EC9706细胞周期停滞于G₂／M期，抑制细胞增殖，这种抑制作用机制可能与D52表达下调介导的抑制细胞有丝分裂有一定的联系。苹果提取物还可能通过抑制与细胞的生长、去分化和癌症有关的甲硫氨酸腺苷基转移酶Ⅱ的表达发挥抗肿瘤作用。5．经苹果提取物作用后，与细胞代谢、信号转导、细胞骨架组成、氧化应激、免疫、细胞增殖和凋亡以及分子伴侣有关的多种蛋白表达水平发生了变化。提示苹果提取物可作用于细胞代谢、信号转导、氧化应激等多种途径。鉴定的蛋白质可以作为苹果提取物作用的生物标志物，同时有可能成为临床上治疗食管癌药物作用的靶分子。苹果提取物调节微管去稳蛋白和微管蛋白伴侣分子表达，可影响细胞有丝分裂阻止肿瘤细胞生长；苹果提取物上调蛋白激酶C抑制剂，提示PKCI途径可能是苹果提取物发挥抗肿瘤作用的机制之一；对肿瘤细胞的作用与抑制泛素-蛋白酶体途径，去泛素化作用有关，潜在的机制可能涉及泛素-蛋白酶体途径介导的IKB降解，进而阻断NF-κB的活化，影响细胞内的信号传导过程；苹果提取物的抗氧化，预防氧化应激损伤与HMC蛋白有关，其抗氧化、抗炎的机制可能是通过HMC介导的；苹果提取物与蛋白质酪氨酸激酶抑制剂染料木黄酮作用相同的是，可下调异质性核内核糖核蛋白和上调微管去稳蛋白，表明这两种蛋白是它们作用的共同靶分子，提示苹果提取物可能具有酪氨酸激酶抑制剂作用；苹果提取物下调微管蛋白分子伴侣，这一作用类似抗肿瘤药物紫杉醇，微管蛋白分子伴侣是其作用的靶分子。苹果提取物可抑制醛缩酶A表达，醛缩酶A是肝癌诊断的标志物，也是药物作用的靶分子。提示苹果提取物在作用和途径上与某些抗肿瘤药物类似。6．综合研究结果表明苹果提取物和叶黄素作用后导致的细胞生长抑制、诱导凋亡与基因和蛋白表达的改变之间有着潜在的联系。由于苹果提取物中黄酮类化学物的综合作用，调节了多种基因和蛋白的表达，进而经由细胞代谢、信号通路、氧化应激、免疫调节等多途径，最终导致肿瘤细胞增殖的抑制和促进凋亡而发挥抗癌作用。