论文部分内容阅读
[背景]人类肠道病毒(Enteroviruses, EVs)型别众多,通常以无症状的隐性感染为主,但也可引起急性弛缓性麻痹(Acute Flaccid Paralysis, AFP)、脑膜炎或脑炎、手足口病(Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD)、急性出血性结膜炎、心肌炎、类感冒病症等多种疾病,是重要的人类致病病原。EVs基因组全长约7.5kb,为单股正链RNA,包括5’端非编码区(5’-nontranslated Region,5’ NTR),编码多聚蛋白的单一开放读码框(Open Reading Frame, ORF)和3’NTR3个组成部分。1999年,Oberste等首次提出了基于EV VP1序列的分子生物学定型方法。传统血清学方法无法定型的EVs陆续被鉴定出来,目前已分离到40多个新型EVs基因型。其原型株的全基因组多数已经测序完成,但其他分离株的全基因组序列信息有限。EVs进化活跃,目前已经发现的新型EVs,如EV-A76, EV-B74, EV-C96等,均有点突变和型内重组发生。对新型EVs全基因组特征的分析,能够全面掌握毒株的重组和进化特点,并为基因组数据库提供全面的序列信息,对于分析病毒在地区及全球的传播情况提供参考依据。新型EVs虽然发现较晚,但已与多起疾病暴发相关,如EV-A71已在东亚和东南亚地区引发数起HFMD大流行,成为全球的重大公共卫生问题。另外,EV-B75、 EV-A76和EV-A89与2006年印度、西班牙等国家的病毒性脑炎暴发有关。某些新型EVs的感染还表现为发热、消化道和／或呼吸道症状,常常不易鉴别,这给疾病的预防与早期诊治带来很大困难。进行EVs血清流行病学研究能够掌握人群中EVs抗体携带情况,了解人群的易感性和免疫水平的动态变化,为疾病的预防提供参考依据。目前仅有少数新型EVs的血清流行病学研究报道。[研究目的]1.在前期研究的基础上,继续对发现的部分新型EVs山东分离株(EV-A71C2亚型,EV-B74, EV-B80, EV-B87)的全基因组特征进行分析；2.选择部分新型EVs山东分离株(EV-A71C4亚型,EV-B87, EV-A90),对健康人群的血清中和抗体水平进行检测分析。[研究方法]1.对已经鉴定出的新型EVs山东分离株(EV-A71C2亚型、EV-B74、 EV-B80、EV-B87)进行全基因组序列测定。2.使用BioEdit7.1.7软件,对新型EVs山东分离株与原型株间核苷酸、氨基酸序列相似性进行比对。3.采用Mega4.0软件,以邻位法(Neighbor-joining Method)与同型分离株构建P1、P2、P3区系统发生树,对新型EVs山东分离株进行进化重组分析。4.使用Simplot3.5.1软件,分析新型EVs山东分离株与同型分离株在基因组中的重组。5.选择部分新型EVs山东分离株(EV-A71C4亚型,EV-B87, EV-A90),对健康人群血清中和抗体水平进行检测分析。[主要结果]1.新型EVs全基因组序列特征分析全基因组序列特征分析显示,EV-A74、EV-B80、EV-B87的非结构蛋白编码区均发现了基因重组的证据。在该区域,EV-A74山东株与E13和E19原型株序列同源性较高；EV-B80山东株与E19、E27和E13原型株序列同源性较高；EV-B87山东株与CVB2、EV-B85和EV-B98原型株序列同源性较高。EV-B80山东株相比其原型株,在衣壳蛋白VPl编码区3’端有36个核苷酸插入。插入位点正是不同基因型间衣壳蛋白编码区长度变化的区域。EV-A71C2亚型山东株96200的全基因组序列分析发现,96200在P1、P2和P3区与EV-A71C2亚型的澳大利亚分离株7F/AUS/6/99、台湾分离株NCKU9822、Tainan/5746/98/TW/1998和pinf7-54A均在同一分支；与类EV-A71C2亚型台湾分离株2008-00643仅P1区在同一分支,在P2和P3区分属不同分支。Simplot同源重组分析发现,在P1、P2和P3区,96200与7F/AUS/6/99、NCKU9822、Tainan/5746/98/TW/1998和pinf7-54A序列相似性均超过90‰与2008-00643、EV-A71原型株BrCr及EV-A71山东地方株JN01/10的相似性,P1区明显高于P2和P3区。2.新型EVs血清流行病学分析血清流行病学研究所用标本来自2010年脊髓灰质炎病毒中和抗体监测用血清标本,标本来自10个年龄组,共计390份。EV-A71、EV-B87和EV-A90在人群中的抗体阳性率分别为46.0%、47.0%和8.8%。EV-A71、EV-B87和EV-A90在人群中的抗体阳性率与年龄关系较为密切,在7个月～2岁左右出现最低值,之后逐渐增高。EV-A71、EV-B87和EV-A90在人群中几何平均滴度(Geometric Mean Titer,GMT)分别为1：5.20、1：4.02和1：1.49,在7个月-2岁左右出现最低值,在5-14岁学龄段出现高值。3.5%的人群EV-A71的GMT≥1：256,符合HFMD实验室诊断病例的标准。仅有0.3%的调查者出现EV-A90的GMT≥1：256,无调查者出现EV-B87的GMT≥1：256。[主要结论]1.本研究对EV-A71C2亚型以及EV-B74、EV-B80和EV-B87型山东地方株进行了全基因组序列分析。除EV-B74之外,其他均为国内首次报道的全基因序列。2. EV-A71C2亚型分离株在1996～1999年间较为保守,根据现有的基因组数据库资料未发现重组的证据。相比1996～1999年的EV-A71C2亚型分离株,2008年台湾类EV-A71C2亚型分离株2008-00643已经发生了重组。3. EV-B74、EV-B80、EV-B87山东分离株与其他EV-B组肠道病毒在P2和P3非结构蛋白编码区发生重组。EV-B80的基因组比对结果显示,核苷酸的插入和缺失也是EV结构蛋白基因进化的机制之一。4.7个月-2岁儿童EV-A71、EV-B87和EV-A90抗体阳性率最低,可能是EV的易感人群。5.EV-B87可能与某些流行的EVs间存在交叉抗体反应,人群中天然形成了EV-B87免疫屏障,由此推测EV87可能不会引发大范围的流行。6.EV-A90在人群中抗体阳性率较低,而全球和国内分离毒株相对较多,涉及地理范围广,需要对其加强监测。7.5-14岁年龄组儿童EV-A71、EV-B87和EV-A90中和抗体GMT最高,是感染易发生的年龄段,应加强在学龄儿童中的预防工作,必要时应研发疫苗开展预防接种。