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莱克多巴胺是一种β2-兴奋剂,能够加强心脏收缩、扩张骨骼肌血管和支气管平滑肌,在兽医学和医学上可用于治疗休克和支气管痉挛。莱克多巴胺还具有加强体内代谢的作用,可以促进脂肪分解和蛋白质合成。但当人体累计摄入量超过一定值,或食入莱克多巴胺高残留量的食物时,会产生毒副作用。因此,欧洲以及中国都禁止莱克多巴胺用于家畜饲养中,在中国非法使用莱克多巴胺的报道却不断出现,它是继瘦肉精后广泛被用于家畜饲养的β2-兴奋剂。目前莱克多巴胺的检测远远不能满足快速,廉价,稳定和准确等方面的要求。本研究旨在建立两种免疫分析方法用于样本中莱克多巴胺的快速筛选。本研究内容主要包括以下三个部分:1)莱克多巴胺人工抗原的制备本研究先将莱克多巴胺与琥珀酸酐在吡啶溶液中反应,连接上羧基后,采用改良的EDC法——EDC-NHS法,并使用阳离子化的牛血清白蛋白作为免疫抗原偶联载体,卵清蛋白作为包被抗原偶联载体。研究结果表明,莱克多巴胺琥珀酸酐活化率达到85%,莱克多巴胺琥珀酸酐:EDC:NHS摩尔比为1:2:5,活化时间为15 min,偶联时间为2 h,莱克多巴胺琥珀酸酐:蛋白质起始摩尔比20:1。最后免疫抗原莱克多巴胺与阳离子化牛血清白蛋白（Bovine serumalbumin,简称为BSA）的偶联物,偶联比达到14.3,偶联效率达到71.5%;包被抗原莱克多巴胺与卵清蛋白（Ovumalbumin,简称为OVA）,偶联比为7.5,偶联效率达到37.5%。2)莱克多巴胺间接竞争ELISA法的建立用以上制备的莱克多巴胺与阳离子化牛血清白蛋白的偶联物作为免疫原,制备抗莱克多巴胺的单克隆抗体,将获得的抗莱克多巴胺单克隆分离纯化后,用于建立ELISA检测方法。建立了莱克多巴胺间接竞争ELISA检测方法,各生产工艺参数如下:包被抗原0.6μg/mL,1.18 mg/mL抗体稀释8000倍,1mg/mL酶标二抗（山羊抗小鼠）稀释5000倍。制备的ELISA法检测灵敏度为0.1 ng/mLIC50为2 ng/mL,检测范围为0.1～1000 ng/mL,与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、特布他林等四种结构类似物的交叉反应率均小于0.2‰。用该ELISA法对经气质联用法验证为莱克多巴胺阴性猪尿样本进行加标回收实验,回收率为70%～106.2%。3)莱克多巴胺胶体金免疫层析法的建立将得到的抗莱克多巴胺单克隆抗体用于制备金标抗体,制备的人工抗原莱克多巴胺—卵清蛋白用于包被NC膜。莱克多巴胺胶体金免疫层析试纸条的生产工艺参数如下:胶体金颗粒大小为40 nm,标记抗体量为10μg/mL,喷金OD值为5,抗原浓度为0.5 mg/mL。参照以上条件组装的莱克多巴胺胶体金免疫层析试纸条检测灵敏度达到5 ng/mL,检测范围为0～10000 ng/mL,与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、特布他林等四种结构类似物的交叉反应率均小于5‰。对100份样本进行检测,假阴性率为0,假阳性率为3.2%。60℃加速保存实验表明,预计保质期可达12个月以上。总之,建立的两种免疫学方法都有很好的检测灵敏度和很高特异性,可以用于莱克多巴胺的快速筛查。