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解酯耶式酵母(Yarrowia lipolitica)是一种非常规性的、严格好氧的酵母,其生长温度为25～30℃,生存pH 3.0～8.0,能以糖类、油脂类以及烃类等广泛低廉物质作碳源,同时Y.lipolitica所产的脂肪酶能参与催化水解、酯化、转酯、酯交换等多种化学反应,特别是其对色拉油具有高效降解能力,目前已广泛运用于油脂废水的处理。因此利用Y.lipolitica进行低成本脂肪酶生产,并对其所产脂肪酶进行提取纯化具有十分重要的现实运用意义。本研究以实验室保藏的Y.lipolitica W29为出发菌株,以脂肪酶酶活为指标,采用正交实验、单因素试验优化了Y.lipolitica W29利用色拉油脂+水生产脂肪酶的工艺条件,并在此基础上采用单因素试验对其摇瓶发酵工艺进行优化；随后通过硫酸铵盐析、透析、DEAE-Sepharose FF离子层析、PEG20000浓缩等步骤对摇瓶发酵上清液中的脂肪酶进行了纯化与浓缩,并初步研究了其酶学性质。实验室前期试验结果显示Y.lipolitica W29对色拉油有高效降解能力,在此基础上,以培养温度28℃、发酵摇床转速150 r/min、培养基起始pH自然、2.5%接种量为发酵培养条件,在色拉油+水的发酵培养基中,发酵培养48 h后,测得酶活为0.52 U/mL,结果提示Y.lipolitica W29在其对色拉油有高效降解能力的条件下,并不利于脂肪酶的生产。为进一步提高菌株产酶,试验分别以YPD与YPD+色拉油为菌种液进行发酵培养,所得脂肪酶酶活性分别为1.38 U/mL和1.75 U/mL,结果提示,提前诱导菌种有利于产酶,但菌株产酶量依然很低。在此基础上,试验分别对培养温度、摇床转速、培养基起始pH进行了单因素分析,结果显示培养温度30℃、发酵摇床转速100r/min、培养基起始pH 8.0,产酶酶活最高为1.70 U/mL,较未优化前提高了3倍。为考察培养条件之间的交互作用,试验按照单因素结果进行正交试验,结果显示,培养温度25℃、发酵摇床转速50 r/min、培养基起始pH 8.0,产酶酶活最高为2.44 U/mL,较优化前酶活提高了近5倍。总体来看,菌株产酶较优化前虽然提高较多,但其利用色拉油+水培养基所产酶活依然很低,结果提示,对其产酶条件还需优化。Y.lipolitica W29分别以YPD、YPD+色拉油、引用培养基为发酵培养基进行产酶条件优化,发现引用培养基最利于脂肪酶的生产,其优化后培养基成分为：蔗糖0.1%、蛋白胨2.5%、尿素0.1%、MgSO4 0.1%、NaCl1.5%、吐温-800.1%：最优培养条件为：培养温度30℃、摇床转速150r/min、培养基起始pH 7.0、接种量2.5%。在该条件下,以7g/L橄榄油为诱导剂时,发酵培养60 h时,脂肪酶产量达到最高,其酶活为7.70 U/mL；而以7g/L色拉油为诱导剂时,发酵培养36 h时,其产酶达到最高,酶活为4.04 U/mL。分离纯化脂肪酶后结果显示：有两种不同且都具有脂肪酶活性的纯化蛋白,分别标记为纯化酶1和纯化酶2；用SDS-PAGE方法检测纯化酶1分子量为37～38kD,纯化酶2的分子量为41-42 kD；进一步研究发现：两种酶的最适温度为40℃,在温度为30～50℃C时都能保持较高酶活性；最适pH都为8.0,且在pH 6.5～8.0时酶活都保持相对稳定：实验中还发现Mg2+、Ca2+、Li+对纯化酶1和纯化酶2均有较强的激活作用,而Fe3+、Na+对两者酶活性有一定的抑制作用,Cu2+对两者酶活性抑制更强,即酶液在含Cu2+的条件下,几乎没有脂肪酶活性,值得注意的是Zn2＋,其对纯化酶1有明显的促进作用,但其对纯化酶1却有强烈的抑制作用；SDS、CTAB、吐温-80对两者酶活都有明显的抑制作用,而PEG1750, PEG20000在0.5%的含量范围内,对纯化酶1和2的酶活性都有显著的激活作用。