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[背景与目的]：
肝癌缺失基因-1(frequently deleted in liver cancer，DLC-1)基因，位于人类染色体8p21．3-22，是一个新的候选抑癌基因。1998年Yuan等首先从原发性肝癌组织中分离出来，并认为该基因改变是肝癌发生的早期事件之一。随后，人们发现DLC-1在大多数肿瘤中表达下降或缺失，体内外实验也证明DLC-1基因可抑制多种肿瘤细胞生长和致瘤性。本课题组应用RNAi技术成功下调DLC-1阳性结肠癌LoVo细胞的DLC-1 mRNA表达，结果显示该基因可促进LoVo细胞的增殖及侵袭，影响细胞周期重新分布。但其作用机制尚不清晰。有研究表明，DLC-1基因的RhoGAP(Rho GTPase activating protein．RhoGAP)结构域可能是其抗肿瘤作用的主要机制[4]。因此本研究在前期工作基础上，拟应用脂质体转染技术使DLC-1阴性表达的HT29结肠癌细胞株恢复表达，同时亦将RhoGAP(gho GTPase activating protein)结构域缺失的△DLC-1亚克隆序列转染至HT29细胞，以进一步探讨DLC-1基因在大肠癌中的生物学作用及其分子机制。
[方法]：
1．RT-PCR，Western blotting检测三株大肠癌HT29、LOVo、CaCo-2细胞中DLC-1基因的表达。
2．构建DLC-1基因重组质粒pcDNA3．1-DLC1以及RhoGAP结构域敲除的△DLC-1基因亚克隆重组质粒pcDNA3．1-△DLC1。
3．脂质体介导将pcDNA3．1-DLC1和pcDNA3．1-ΔDLC1重组质粒分别转染结肠癌HT-29细胞，并通过PCR电泳、双酶切(XbaⅠ，BamHⅠ)实验结果和测序进行鉴定。
4．Rock激酶(Rho-associated kinase，ROCK)激动剂AngiotensinⅡ，ROCK抑制剂Y27632分别处理细胞。
5．MTT、平板克隆实验、Transwell侵袭实验、流式细胞仪技术分别检测细胞生物学行为改变。
6．谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transfcrase，GST)Pull-down技术分析RhoA蛋白活性。
7．Realtime-PCR和Western blotting检测p21、cyclinD1的表达。
8．Western blotting检测ROCK、Erk激酶活性。
[结果]：
1．首先筛选出DLC-1阴性表达的HT29结肠癌细胞株，而CaCo-2和LoVo细胞株DLC-1基因表达为阳性，继而成功构建pcDNA3．1-DLC1重组质粒并转染HT29细胞。RT-PCR和Western blotting证实DLC-1在转染组HT29细胞中恢复表达。
2．MTT实验结果显示，随着细胞培养时间的逐渐延长，转染组细胞生长曲线增长幅度较对照组和空载组细胞降低(P<0．05)。平板克隆实验结果显示，转染组与对照组和空载组相比其克隆形成的数目减少，且克隆体积减小(p<0．05)。Transwell小室实验结果显示，转染组HT29细胞穿过基底膜的细胞数少于对照组和空载组(P<0．05)。流式细胞仪结果表明，转染组与对照组、空载组细胞相比，G1期细胞比例及凋亡细胞比例上升，而分裂前期G2期细胞比例下降(P<0．05)。
3．Pull-down assay结果表明DLC-1在HT29细胞中恢复表达可导致RhoA蛋白活性下降，Western blotting显示转染组细胞周期调控因子p21WAF1/CIP1表达上调，cyclinD1表达下调，Rock激酶的重要底物p-MLC表达下调，p-Erk1/2表达下调。
4．转染组pcDNA3．1-DLC1-HT29细胞的p-MLC蛋白表达已较对照组明显下调(P<0．05)，继以ROCK抑制剂Y27632处理后，p-MLC蛋白表达完全抑制，而转染组以ROCK激动剂AngiotensinⅡ处理后，p-MLC蛋白表达明显上调。结果提示：DLC-1基因在HT29细胞中对Rock激酶活性的特异性抑制作用。
5．成功构建RhoGAP区域缺失的pcDNA3．1-ΔDLC1重组质粒，转染至HT29细胞，但对细胞增殖、侵袭和细胞周期分布无明显影响。
[结论]：
1．恢复DLC-1基因表达显著抑制HT29细胞的增殖、侵袭能力，并导致细胞周期G1期阻滞及诱导凋亡，进一步证实DLC-1基因在结肠癌细胞中的抑癌基因功能。
2．RhoA蛋白通路是DLC-1内在的RhoGAP结构域作用的主要靶点，转染DLC-1基因通过下调RhoA活性，进而降低ROCK激酶活性，抑制HT29细胞侵袭；同时DLC-1基因可能通过抑制RhoA蛋白活性而影响细胞周期关键因子p21WAF/CIP1和cyclin D1的表达，并参与调节Ras信号通路，下调Erk激酶活性，从而抑制细胞周期和细胞增殖。
3．DLC-1基因在结肠癌细胞中的抑癌基因功能在很大程度上是RhoGAP依赖性的，敲除RhoGAP结构域的DLC-1基因序列对HT29细胞增殖、侵袭和细胞周期无明显影响。