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【背景】胃癌是我国致死人数最多的癌症之一。由于多药耐药现象的存在，常常导致化疗失败。多药耐药（MDR：multidrug resistance）即指恶性肿瘤同时对多种结构和作用机制不同的化疗药物产生交叉耐药。可分为两种，一种为天然性耐药（intrinsic resistance）,即化疗前即有耐药；另一种为获得性耐药（acquired resistance），即化疗过程中产生的耐药。多药耐药机制非常复杂，针对恶性肿瘤治疗抗性问题，从以往的基因转录及蛋白翻译水平均未能深入地解答这些问题，需要通过新的角度来深入探索，以阐明胃癌耐药的机制。长链非编码RNA（long non-coding RNA,简称lncRNA）是最近备受瞩目的哺乳动物转录组重要成员。与蛋白编码基因相比，它具有明显的组织特异性及发育阶段特异性，更可从多个角度调节蛋白编码基因的表达及修饰，如对蛋白编码基因的表观遗传学调节等。因此，lncRNA失调成为多种癌症的特征之一。lncRNA的发现为研究恶性肿瘤的生物学行为、揭示恶性肿瘤化疗耐药本质提供了重要契机。研究多药耐药细胞与亲本药敏细胞之间lncRNA表达谱变化，并深入研究这些差异表达lncRNA分子与相应表观遗传修饰剂之间的相互作用对重要耐药相关分子基因发生表观基因组学变化的影响及机制将为解析恶性肿瘤多药耐药机制提供新视角，以及治疗的新靶点和新策略。【目的】通过高通量lncRNA芯片比较胃癌耐药细胞与亲本细胞lncRNA表达谱差异；通过差异倍数、基因位点比对、邻近编码基因信息分析、phylop物种进化保守性评分等多步筛选策略筛选胃癌耐药相关lncRNAs分子；对其中关键lncRNAs分子在胃癌耐药细胞的表达进行验证；探讨关键lncRNAs分子在胃癌组织中的表达水平与胃癌组织体外组织培养药物敏感度的相关性；进一步探讨关键lncRNAs分子对胃癌耐药细胞表型的影响及其机制，从而为逆转胃癌细胞耐药治疗提供新的靶点以及为关键lncRNAs分子未来应用于临床奠定初步的理论基础和实验依据。【方法】1.利用高通量lncRNA芯片（Human LncRNA Microarray V1.0：HumanHX12LNC; Genome Build:HG18,Build36; http://www.arraystar.com/Products/productmain. asp?id=239）比较胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR、SGC7901/VCR与亲本细胞SGC7901lncRNA表达谱差异。2.通过差异倍数、邻近编码基因信息分析、基因位点比对、phylop物种进化保守性评分、表达验证等多步筛选策略初步筛选胃癌耐药相关lncRNAs分子。3.通过实时定量PCR验证lncRNA DMTF1v4在40例胃癌临床标本中相对于正常癌旁组织的表达水平；分别检测40例胃癌标本体外组织培养药物敏感率，并分析DMTF1v4的表达水平与药物敏感率之间相关性。4.以小干扰RNA瞬转下调DMTF1v4在胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR以及SGC7901/VCR中的表达，通过MTT检测、平板克隆实验、药物半数致死剂量（IC50）检测等验证DMTF1v4的下调对胃癌耐药细胞药物敏感度的影响。5.通过流式细胞术、蛋白印迹实验等检测DMTF1v4下调在不同相应时间对胃癌耐药细胞SGC7901/ADR凋亡的影响。6.以阿霉素蓄积潴留实验验证DMTF1v4下调不同时间后，化疗药物阿霉素在胃癌耐药细胞SGC7901/ADR中蓄积以及外排比例。7.通过蛋白印迹实验检测DMTF1v4下调后对胃癌耐药细胞SGC7901/ADR及SGC7901/VCR中耐药关键蛋白的影响。8.构建DMTF1v4下调慢病毒载体，并成功建立DMTF1v4下调的稳转细胞系LV-DMTF1v4SGC7901/ADR,构建裸鼠皮下异位胃癌耐药细胞移植瘤模型，检测DMTF1v4的下调对胃癌耐药细胞药物敏感度的影响。9.慢病毒稳转以及小干扰RNA瞬转下调DMTF1v4后，通过实时定量PCR、蛋白印迹等实验分别检测SGC7901/ADR细胞株中于不同时间随着DMTF1v4表达水平变化而导致P-糖蛋白表达水平的变化。10.以LV-DMTF1v4SGC7901/ADR细胞构建裸鼠皮下异位移植瘤模型，4周后取肿瘤组织切片，以免疫组织化学、免疫荧光染色以及蛋白印迹实验等检测DMTF1v4下调组与对照组P-糖蛋白表达水平差异。11.克隆DMTF1v4分子含启动子上游1500bp及第一个外显子在内的DNA片段，分别与DMTF1v4分子cDNA第一个外显子以外其他不同区段PCR产物通过同源重组原理构建DMTF1v4分子不同片段，将其通过同源重组插入荧光素酶报告基因载体pGL4.24中并转染入293细胞，检测荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性之比的变化并进行统计学分析。【结果】1．高通量lncRNA芯片比较发现：SGC7901/ADR、SGC7901/VCR与亲本细胞SGC7901相比分别有1499以及1420条差异表达lncRNAs，并且，相交集的差显lncRNAs有627条，其中，NR024549（DMTF1v4）可能是胃癌耐药关键分子。我们通过高通量lncRNA芯片（Human LncRNA Microarray V1.0）比较了胃癌耐药细胞系与其亲本细胞lncRNA表达谱差异。Change fold>=2.0者被认为存在差异表达。基于以上筛选策略，我们发现与亲本细胞SGC7901相比，SGC7901/ADR、 SGC7901/VCR细胞系分别有1499以及1420条差异表达lncRNAs，相交集的差显lncRNAs有627条（lncRNA-Cs）。其中，changefold>=4.0者共有32个，包括在胃癌耐药细胞中上调的NR024549,NR024074,uc002hfi,uc001vtj,uc003wbn,NR026673,NR015379,uc002odt,uc010heq,NR027241,uc002wcb,uc010hhg,uc001aqd,uc002jmb,ucoo3wig,uc003whs,以及下调的NR026867， NR027339，NR027282,uc002uov,uc003gnd,uc001ras,uc002rvu,uc003dhh,uc010jya,uc001ekz,uc003tbi,uc001jtu,uc010itd,uc002ued,uc010dga,uc010cny。其中，NR024549（DMTF1v4）在两耐药细胞中（相对亲本细胞）上调倍数最为显著（SGC7901/ADR-SGC7901change fold=25.89SGC7901/VCR-SGC7901change fold=21.42）。2.通过差异倍数、邻近编码基因信息分析、phylop物种进化保守性评分、表达验证等多步筛选策略提示DMTF1v4可能是胃癌耐药关键lncRNA分子。1)基因芯片差异倍数结果显示：与亲本细胞相比， NR024549（DMTF1v4）在两耐药细胞中上调倍数最为显著（SGC7901/ADR-SGC7901change fold=25.89SGC7901/VCR-SGC7901changefold=21.42）。2)邻近编码基因信息分析表明：以800Kb范围分析627条lncRNA-Cs邻近编码基因信息中，发现，分别有大约5%，21%及12%的lncRNA-Cs基因位点附近存在耐药相关基因，致癌基因及抑癌基因的表达。其中，距DMTF1v4下游307Kb处即为经典耐药关键基因ABCB1（MDR1：P-糖蛋白编码基因）。3) phylop物种进化保守性评分表明：lncRNA DMTF1v4具有较高多物种间进化保守性。（Mean±Sd：0.245989±1.14945）4)实时定量PCR结果显示：相对于亲本细胞SGC7901，DMTF1v4在两耐药细胞系中的表达水平明显上调，且上调水平相对于其他15条lncRNA芯片结果中上调表达的lncRNAs（change fold>=4.0）最为显著。3. lncRNA DMTF1v4在原发性胃腺癌组织中的表达水平与体外组织培养药物敏感率呈负相关。我们首先通过实时定量PCR检测40例原发胃腺癌组织中DMTF1v4与癌旁正常组织相比的相对表达水平，根据中位数，将40例原发胃腺癌组织分为DMTF1v4高表达组及低表达组。分别检测两组胃腺癌组织体外组织培养药物（阿霉素）抑制率，发现DMTF1v4表达水平与药物抑制率呈负相关。并且，DMTF1v4高表达组及低表达组中，DMTF1v4的表达水平与药物抑制率呈线性负相关（p<0.05）。4. DMTF1v4的下调增加了胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR以及SGC7901/VCR对P-糖蛋白相关化疗药物敏感度。为检测DMTF1v4对胃癌细胞耐药表型的影响，我们首先使用以小干扰RNA瞬转的方法下调该分子在胃癌耐药细胞系中的表达，通过系列检测方法验证其在胃癌细胞耐药中的功能。1) MTT检测结果表明：DMTF1v4表达水平下调后，SGC7901/ADR以及SGC7901/VCR细胞在阿霉素、长春新碱等P-糖蛋白相关化疗药物作用下生长率显著低于对照组。2)平板克隆实验显示：DMTF1v4表达水平的下调显著抑制了SGC7901/ADR细胞在阿霉素作用时的细胞克隆形成率。3)药物半数致死剂量（IC50）检测表明：DMTF1v4表达水平的下调显著增加了SGC7901/ADR细胞对P-糖蛋白相关化疗药物如阿霉素、长春新碱、紫杉醇等的敏感度。5.下调DMTF1v4的表达能显著增加SGC7901/ADR细胞的凋亡。通过流式细胞术检测显示，下调DMTF1v4表达水平导致SGC7901/ADR细胞与对照组相比72h后凋亡比例显著增加。蛋白印迹实验也表明，DMTF1v4下调组于72h后Bcl-2表达水平显著下降而Bax表达水平显著上调，Bcl-2/Bax比例下降。6. DMTF1v4表达水平下调使胃癌耐药细胞SGC7901/ADR中化疗药物阿霉素蓄积比例增加、外排比例减少。阿霉素蓄积潴留实验表明：相对于对照组，DMTF1v4表达下调72h后，化疗药物阿霉素在胃癌耐药细胞SGC7901/ADR中蓄积比例增加，外排比例减少。7.下调DMTF1v4表达使SGC7901/ADR及SGC7901/VCR细胞中耐药关键蛋白P-糖蛋白表达水平下调。通过蛋白印迹实验表明DMTF1v4下调3d后，胃癌耐药细胞SGC7901/ADR及SGC7901/VCR中耐药关键蛋白P-糖蛋白表达下调，而多药耐药相关蛋白（MRP）的表达没有显著变化。8.裸鼠皮下异位移植瘤实验表明DMTF1v4下调组肿瘤增殖被抑制。构建DMTF1v4下调慢病毒载体，以DMTF1v4下调稳转细胞系LV-DMTF1v4SGC7901/ADR构建裸鼠皮下异位胃癌耐药细胞移植瘤模型，尾静脉注射0.5mg/Kg阿霉素1次/周，于规定时间测量肿瘤体积及重量，结果表明，与对照组相比，DMTF1v4下调组肿瘤增殖明显受抑制。9. DMTF1v4表达下调导致SGC7901/ADR细胞P-糖蛋白表达水平随之显著下调。以慢病毒稳转以及小干扰RNA瞬转在SGC7901/ADR细胞中下调DMTF1v4的表达后，实时定量PCR以及蛋白印迹等实验结果显示P-糖蛋白表达水平也随之显著下降。10.裸鼠皮下异位成瘤实验表明，DMTF1v4下调组P-糖蛋白表达水平显著下降。以LV-DMTF1v4SGC7901/ADR细胞构建裸鼠皮下异位移植瘤模型，4周后取肿瘤组织切片，以免疫组织化学、免疫荧光染色以及蛋白印迹实验等表明DMTF1v4下调组与对照组相比P-糖蛋白表达水平显著下降。11.双荧光素酶报告基因结果表明，DMTF1v4通过增强子样作用促进P-糖蛋白的表达。通过克隆DMTF1v4分子含启动子上游1500bp及第一个外显子在内的DNA片段，分别与DMTF1v4分子cDNA第一个外显子以外其他不同区段PCR产物通过同源重组原理构建DMTF1v4分子不同片段，将其通过同源重组插入荧光素酶报告基因载体pGL4.24中并转染入293细胞，检测荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性之比的变化并进行统计学分析，发现DMTF1v4，尤其是在相当于其外显子540bp至其1400bp片段区域对P-糖蛋白的表达有增强子样作用。【结论】通过高通量lncRNA芯片比较，我们首次发现了一组胃癌多药耐药相关lncRNAs分子，而DMTF1v4可能是这组分子中影响胃癌耐药性状的关键lncRNA分子；DMTF1v4通过促进细胞膜P-糖蛋白的表达导致胃癌耐药细胞系中P-糖蛋白相关化疗药物外排增多、摄入减少进而对P-糖蛋白相关化疗药物产生耐药。从转录水平阐明了胃癌耐药细胞系P-糖蛋白表达上调的新机制，为逆转胃癌细胞耐药提供了新靶点。