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背景和目的：心肌缺血可通过感觉神经的传入信息影响颈部交感神经节细胞的功能，进而加强交感节后神经元活动，引起血压升高和心率加快等交感兴奋性反射。心肌缺血产生ATP与嘌呤能受体在伤害性感觉传递中起重要作用。嘌呤能受体中P2X3受体选择性在伤害性感觉神经元高表达。支配心脏的颈上和星状神经节细胞中有P2X3受体表达。我们实验室的研究显示ATP通过激活心脏传入神经通路中的颈上交感神经节(SCG)、星状交感神经节(SG)细胞的P2X3受体参与了心肌缺血伤害性信息的传递。葛根素为豆科植物葛根中提取的一种异黄酮类化合物，具有扩张冠脉和脑血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收缩功能、促进血液循环、对中枢神经系统神经细胞的保护等作用。我们实验室前期研究表明葛根素可抑制背根神经节和结状神经节细胞P2X3受体激动剂激活的电流，减少或抑制伤害性感觉信息的传递。但葛根素对颈部交感神经节细胞P2X3受体介导心肌缺血引发交感反射是否产生作用，目前尚无文献报道。本实验拟通过观察葛根素处理心肌缺血前后颈上、星状交感神经节细胞的P2X3受体和酪氨酸羟化酶(TH)表达的变化，探讨葛根素对颈上、星状交感神经节细胞P2X3受体介导的心肌缺血伤害性信息引发交感反射的影响，这将有助于人们进一步了解葛根素在心肌缺血治疗中的作用及其可能作用靶点，并为其防治冠心病心肌缺血、心肌梗死提供新的实验依据。
方法：
(1)建立心肌缺血大鼠模型，心电图、心肌HE染色观察葛根素对心肌缺血损伤的作用；
(2)无创法血压计检测心肌缺血模型组、葛根素干预的心肌缺血模型组大鼠的血压、心率及呼吸变化，并与葛根素对照组和生理盐水对照组比较；
(3)免疫荧光双标观察各组大鼠SCG、SG细胞和心肌P2X3和TH共表达的变化；
(4)免疫组化方法和蛋白印迹技术了解葛根素对心肌缺血大鼠SCG细胞和SG细胞P2X3受体蛋白表达的影响；
(5)原位杂交的方法观察葛根素干预后SCG细胞和SG细胞P2X3受体mRNA表达的变化。
结果：
(1)心肌缺血损伤的大鼠模型的心电图出现病理性Q波，ST段移位。心肌HE染色显示心肌缺血模型组心肌呈现大面积心肌纤维化和心肌细胞萎缩现象，葛根素干预后可以改善心肌缺血大鼠心电图异常变化和心肌损伤。
(2)心肌缺血模型大鼠收缩压(73．35±2．51mmHg)，心率(445．67±16．58次/分)和呼吸(92．33±5．78次/分)与对照组大鼠收缩压(69．13±0．55mmHg)、心率(366．17±8．44次/分)和呼吸(72．83±2．63次/分)相比增加(n=6)(p<0．05)。葛根素干预组大鼠收缩压(69．85±1．61 mmHg)、心率(374．00±6．89次/分)和呼吸(76．33±2．16次/分)较心肌缺血组大鼠降低(n=6)(p<0．05)。对照组和葛根素干预组无显著性差异(p>0．05)。
(3)免疫荧光双标结果显示在大鼠颈上、星状交感神经节细胞和心肌组织P2X3受体和TH共表达，心肌缺血组高于对照组，葛根素干预心肌缺血后，共表达下降。
(4)免疫组化结果显示颈上神经节P2X3受体表达的光密度值在生理盐水对照组，葛根素对照组，心肌缺血组，葛根素干预组分别为0．10±0．03(n=10)，0．08±0．01(n=10)，0．15±0．03(n=10)，0．07±0．04(n=10)。心肌缺血组P2X3受体表达高于对照组和葛根素干预组(p<0．01；F(3，36)=11．285)，心肌缺血组P2X3蛋白表达较对照组增加(p<0．05)，葛根素干预的心肌缺血组的P2X3蛋白表达较心肌缺血组减少(p<0．05)；对照组和葛根素干预组无显著性差异(p>0．05；F(2，27)=1．292)。星状神经节P2X3受体表达的光密度值在生理盐水对照组，葛根素对照组，心肌缺血组，葛根素干预组分别为0．16±0．02(n=10)，0．15±0．01(n=10)，0．20±0．02(n=10)，0．15±0．01(n=10)。心肌缺血组P2X3受体表达高于对照组和葛根素干预组(p<0．01；F(3，36)=9．544)，心肌缺血组P2X3蛋白表达较对照组增加(p<0．05)，葛根素干预的心肌缺血组的P2X3蛋白表达较心肌缺血组减少(p<0．05)；对照组和葛根素干预组无显著性差异(p>0．05；F(2，27)=0．895)。
(5)原位杂交结果显示颈上神经节P2X3 mRNA表达的光密度值在生理盐水对照组，葛根素对照组，心肌缺血组，葛根素干预组分别为0．13±0．02(n=10)，0．12±0．01(n=10)，0．23±0．03(n=10)，0．12±0．01(n=10)。心肌缺血组P2X3 mRNA表达高于对照组和葛根素干预组(p<0．01；F(3，36)=42．589)，心肌缺血组P2X3 mRNA表达较对照组增加(p<0．05)，葛根素干预的心肌缺血组的P2X3 mRNA表达较心肌缺血组减少(p<0．05)；对照组和葛根素干预组无显著性差异(p>0．05；F(2，27)=1．253)。星状神经节P2X3 mRNA表达的光密度值在生理盐水对照组，葛根素对照组，心肌缺血组，葛根素干预组分别为0．08±0．01(n=10)，0．09±0．01(n=10)，0．12±0．02(n=10)，0．09±0．02(n=10)。心肌缺血组P2X3 mRNA表达高于对照组和葛根素干预组(p<0．01；F(3，36)=11．345)，心肌缺血组P2X3 mRNA表达较对照组增加(p<0．05)，葛根素干预的心肌缺血组P2X3 mRNA表达较心肌缺血组减少(p<0．05)；对照组和葛根素干预组无显著性差异(p>0．05；F(2，27)=0．906)。
(6)蛋白印迹结果经β-actin标化后显示在SCG细胞P2X3受体表达的光密度值在生理盐水对照组，葛根素对照组，心肌缺血组，葛根素干预组分别为0．97±0．02(n=10)，0．98±0．04(n=10)，1．15±0．04(n=10)，0．99±0．03(n=10)。心肌缺血组P2X3受体表达高于对照组和葛根素干预组(p<0．01；F(3，36)=52．418)，心肌缺血组P2X3蛋白表达较对照组增加(p<0．05)，葛根素干预的心肌缺血组P2X3蛋白表达较心肌缺血组减少(p<0．05)；对照组和葛根素干预组无显著性差异(p>0．05；F(2，27)=0．552)。在SG细胞P2X3受体表达的光密度值在生理盐水对照组，葛根素对照组，心肌缺血组，葛根素干预组分别为0．99±0．02(n=10)，0．98±0．02(n=10)，1．11±0．05(n=10)，0．99±0．03(n=10)。心肌缺血组P2X3受体表达高于对照组和葛根素干预组(P<0．01；F(3，36)=26．192)，心肌缺血组P2X3蛋白表达较对照组增加(p<0．05)，葛根素干预的心肌缺血组的P2X3蛋白表达较心肌缺血组减少(p<0．05)；对照组和葛根素干预组无显著性差异(p>0．05；F(2，27)=1．043)。
结论：葛根素可以降低心肌缺血大鼠SCG和SG神经细胞及心肌交感神经P2X3受体表达，从而使心肌缺血大鼠升高的血压下降、加快的心率及呼吸减慢。大鼠颈上神经节、星状神经节神经细胞和心肌交感神经末梢P2X3受体参与心肌缺血引发的交感兴奋反射传递，表明葛根素可能通过作用于P2X3受体抑制心肌缺血伤害性信息引发的交感兴奋反射。
方法：
(1)建立心肌缺血大鼠模型，心电图、心肌HE染色观察葛根素对心肌缺血损伤的作用；
(2)无创法血压计检测心肌缺血模型组、葛根素干预的心肌缺血模型组大鼠的血压、心率及呼吸变化，并与葛根素对照组和生理盐水对照组比较；
(3)免疫荧光双标观察各组大鼠SCG、SG细胞和心肌P2X3和TH共表达的变化；
(4)免疫组化方法和蛋白印迹技术了解葛根素对心肌缺血大鼠SCG细胞和SG细胞P2X3受体蛋白表达的影响；
(5)原位杂交的方法观察葛根素干预后SCG细胞和SG细胞P2X3受体mRNA表达的变化。
结果：
(1)心肌缺血损伤的大鼠模型的心电图出现病理性Q波，ST段移位。心肌HE染色显示心肌缺血模型组心肌呈现大面积心肌纤维化和心肌细胞萎缩现象，葛根素干预后可以改善心肌缺血大鼠心电图异常变化和心肌损伤。
(2)心肌缺血模型大鼠收缩压(73．35±2．51mmHg)，心率(445．67±16．58次/分)和呼吸(92．33±5．78次/分)与对照组大鼠收缩压(69．13±0．55mmHg)、心率(366．17±8．44次/分)和呼吸(72．83±2．63次/分)相比增加(n=6)(p<0．05)。葛根素干预组大鼠收缩压(69．85±1．61 mmHg)、心率(374．00±6．89次/分)和呼吸(76．33±2．16次/分)较心肌缺血组大鼠降低(n=6)(p<0．05)。对照组和葛根素干预组无显著性差异(p>0．05)。
(3)免疫荧光双标结果显示在大鼠颈上、星状交感神经节细胞和心肌组织P2X3受体和TH共表达，心肌缺血组高于对照组，葛根素干预心肌缺血后，共表达下降。
(4)免疫组化结果显示颈上神经节P2X3受体表达的光密度值在生理盐水对照组，葛根素对照组，心肌缺血组，葛根素干预组分别为0．10±0．03(n=10)，0．08±0．01(n=10)，0．15±0．03(n=10)，0．07±0．04(n=10)。心肌缺血组P2X3受体表达高于对照组和葛根素干预组(p<0．01；F(3，36)=11．285)，心肌缺血组P2X3蛋白表达较对照组增加(p<0．05)，葛根素干预的心肌缺血组的P2X3蛋白表达较心肌缺血组减少(p<0．05)；对照组和葛根素干预组无显著性差异(p>0．05；F(2，27)=1．292)。星状神经节P2X3受体表达的光密度值在生理盐水对照组，葛根素对照组，心肌缺血组，葛根素干预组分别为0．16±0．02(n=10)，0．15±0．01(n=10)，0．20±0．02(n=10)，0．15±0．01(n=10)。心肌缺血组P2X3受体表达高于对照组和葛根素干预组(p<0．01；F(3，36)=9．544)，心肌缺血组P2X3蛋白表达较对照组增加(p<0．05)，葛根素干预的心肌缺血组的P2X3蛋白表达较心肌缺血组减少(p<0．05)；对照组和葛根素干预组无显著性差异(p>0．05；F(2，27)=0．895)。
(5)原位杂交结果显示颈上神经节P2X3 mRNA表达的光密度值在生理盐水对照组，葛根素对照组，心肌缺血组，葛根素干预组分别为0．13±0．02(n=10)，0．12±0．01(n=10)，0．23±0．03(n=10)，0．12±0．01(n=10)。心肌缺血组P2X3 mRNA表达高于对照组和葛根素干预组(p<0．01；F(3，36)=42．589)，心肌缺血组P2X3 mRNA表达较对照组增加(p<0．05)，葛根素干预的心肌缺血组的P2X3 mRNA表达较心肌缺血组减少(p<0．05)；对照组和葛根素干预组无显著性差异(p>0．05；F(2，27)=1．253)。星状神经节P2X3 mRNA表达的光密度值在生理盐水对照组，葛根素对照组，心肌缺血组，葛根素干预组分别为0．08±0．01(n=10)，0．09±0．01(n=10)，0．12±0．02(n=10)，0．09±0．02(n=10)。心肌缺血组P2X3 mRNA表达高于对照组和葛根素干预组(p<0．01；F(3，36)=11．345)，心肌缺血组P2X3 mRNA表达较对照组增加(p<0．05)，葛根素干预的心肌缺血组P2X3 mRNA表达较心肌缺血组减少(p<0．05)；对照组和葛根素干预组无显著性差异(p>0．05；F(2，27)=0．906)。
(6)蛋白印迹结果经β-actin标化后显示在SCG细胞P2X3受体表达的光密度值在生理盐水对照组，葛根素对照组，心肌缺血组，葛根素干预组分别为0．97±0．02(n=10)，0．98±0．04(n=10)，1．15±0．04(n=10)，0．99±0．03(n=10)。心肌缺血组P2X3受体表达高于对照组和葛根素干预组(p<0．01；F(3，36)=52．418)，心肌缺血组P2X3蛋白表达较对照组增加(p<0．05)，葛根素干预的心肌缺血组P2X3蛋白表达较心肌缺血组减少(p<0．05)；对照组和葛根素干预组无显著性差异(p>0．05；F(2，27)=0．552)。在SG细胞P2X3受体表达的光密度值在生理盐水对照组，葛根素对照组，心肌缺血组，葛根素干预组分别为0．99±0．02(n=10)，0．98±0．02(n=10)，1．11±0．05(n=10)，0．99±0．03(n=10)。心肌缺血组P2X3受体表达高于对照组和葛根素干预组(P<0．01；F(3，36)=26．192)，心肌缺血组P2X3蛋白表达较对照组增加(p<0．05)，葛根素干预的心肌缺血组的P2X3蛋白表达较心肌缺血组减少(p<0．05)；对照组和葛根素干预组无显著性差异(p>0．05；F(2，27)=1．043)。
结论：葛根素可以降低心肌缺血大鼠SCG和SG神经细胞及心肌交感神经P2X3受体表达，从而使心肌缺血大鼠升高的血压下降、加快的心率及呼吸减慢。大鼠颈上神经节、星状神经节神经细胞和心肌交感神经末梢P2X3受体参与心肌缺血引发的交感兴奋反射传递，表明葛根素可能通过作用于P2X3受体抑制心肌缺血伤害性信息引发的交感兴奋反射。