基于适配体的酶分子检测新方法

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第一章:简要介绍了适配体,其中包括核酸适配体和多肽适配体的概念和优点,论述了基于适配体检测蛋白质的方法应用,阐述了本文的立题背景、研究内容和创新点。第二章:利用核酸适配体的高亲和力和酶反应的信号放大功能,发展了一种荧光分析法检测活化蛋白C。活化蛋白C被修饰在磁球上的核酸适配体捕获,之后特异性地催化荧光底物(D-Val-Pro-Arg-ANSNH-C4H9),生成荧光产物,通过测定产生的荧光产物的荧光强度实现对活化蛋白C的检测。该方法简便,灵敏度高,特异性强。当活化蛋白C的样品体积为250μL,催化反应时间为2小时,检出限为0.4 pM,对应0.1 fmole的活化蛋白C。凝血酶,胰蛋白酶,蛋白酶K,胰凝乳蛋白酶,猪胰弹性蛋白酶对活化蛋白C的检测没有影响。第三章:我们利用亲和性多肽适配体对凝血酶的特异性捕获和凝血酶参与的酶催化反应,发展了一种灵敏度高,特异性强的凝血酶检测法。凝血酶被多肽适配体修饰的磁球捕获后,将荧光底物(N-p-tosyl-Gly-Pro-Arg-7-amido-4-methylcoumarin)催化水解生成荧光产物,通过测定产物的荧光强度来定量检测凝血酶。100μL凝血酶样品的检出限为50fM。该方法灵敏度高,选择性好,并且可以用于人血浆样品中凝血酶的检测。第四章:本章采用与第三章类似的检测原理,使用凝血酶的一种生色底物(序列为N-P-tosyl-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilide)来检测凝血酶。我们以多肽适配体作为识别分子,将多肽适配体固定在磁球上来捕获凝血酶,之后被分离富集的凝血酶特异性的催化生色底物水解生成产物,通过对生成物吸光度的测定实现对凝血酶的定量检测,检出限为1 pM。由于多肽适配体捕获凝血酶的特异性以及酶催化反应的特异性,方法具有良好的选择性。此外,该方法还可以应用于实际样品的检测。
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