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研究背景婴幼儿血管瘤(Infantile hemangioma,IH)是婴幼儿出生后常见的体表肿瘤,其特点表现为出生后才出现,出生后第一年快速增殖,随后缓慢消退,不经治疗的话,病程可持续10-12年。尽管IH有自发消退的倾向,但其消退后残留病灶常影响外观与功能,部分患儿甚至需要手术治疗,对患儿身心造成严重影响。典型的IH可分为三个时期,分别为:增殖期、消退期以及消退完成期。增殖期多为出生后1年,结构特点为IH组织中出现大量无血管结构的内皮细胞团。1年后开始进入消退期,该期内出现血管结构,至消退完成期,瘤体内被脂肪组织替代,含有少量毛细血管结构。尽管IH有自发消退的倾向,但消退的时间及促进消退的因素并不明确。血管生成过程中有三条通路发挥重要的作用,分别是Notch、VEGF与TGFβ信号通路,前期我们发现TGFβ信号通路中的Smad4蛋白在IH发展的不同时期表达量差异明显,主要体现为增殖期低表达,消退期高表达,通过基因芯片筛选我们发现miR-206在IH增殖期呈高表达,而消退期呈低表达,miR-206与Smad4表现出此消彼长的关系,因此,本研究试图通过提取婴幼儿干细胞,构建miR-206不同表达水平的HemSCs,研究miR-206与TGFβ/Smads信号通路在HemSCs中所发挥的作用,及miR-206与TGFβ/Smads信号之间的相互关系及作用机制,从而了解影响IH从增殖期进入消退期的具体分子机制,为IH的治疗提供新的思路。研究目的第一部分:提取血管瘤干细胞(hemangioma-derived stem cells,HemSCs),对所提取的干细胞进行诱导分化,再通过免疫荧光及流式细胞术对所提取细胞表面标记物进行鉴定。第二部分:通过慢病毒转染的方式构建miR-206过表达或干扰细胞株,通过探针法对H e m S C s中的miR-206进行检测,明确细胞内miR-206表达情况。第三部分:探索miR-206不同表达水平的HemSCs的细胞功能,了解miR-206对HemSCs细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期及细胞凋亡的影响,并了解TGFβ1对miR-206不同表达水平HemSCs细胞功能的影响。第四部分:探索miR-206与TGFβ1对HemSCs产生影响的具体分子机制。研究方法第一部分(1)通过组织块贴壁培养扩增原代细胞,再利用CD133免疫磁珠对所扩增的细胞进行分选,随后将所分选的细胞进行单克隆培养。(2)观察所提取细胞的细胞学形态。(3)通过CCK-8检测试剂盒测定细胞生长曲线。(4)进行成管、成骨、成脂及成软骨诱导分化,确定所提取的细胞具有多向分化能力。(5)通过免疫荧光及流式细胞术检测HemSCs细胞表面GLUT-1、CD31、CD133,明确细胞表型。第二部分建立(1)设计pre-miR206及TudRNA(hsa-mir-206)序列,进行双酶切添加过表达及干扰序列至质粒载体并进行测序。(2)将质粒载体包装进慢病毒中进行抽提。(3)慢病毒转染HemSCs并进行嘌呤霉素筛选转染成功细胞。(4)通过观察细胞荧光观察病毒中GFP表达情况(5)通过提取RNA,茎环法反转录miR-206,再经探针法检测细胞中miR-206表达情况。第三部分将miR-206过表达组及其对照组以及miR-206干扰组及其对照组外加空白对照组细胞分别经PBS及TGFβ1干预,再用下列方法检测细胞活性:(1)用Annexin V法经流式细胞术检测细胞凋亡(2)CCK-8检测试剂盒测定各组OD值检测细胞增殖活性(3)Transwell小室检测HemSCs的迁移与侵袭能力(4)PI法检测细胞周期。第四部分(1)通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测经TGFβ1/PBS处理的miR-206不同表达水平HemSCs中TGFβ/Smad信号通路蛋白、VEGF/VEGFR2、EMT相关蛋白mRNA及miR-206的表达情况。(2)通过蛋白印迹(Western Blot)实验检测经TGFβ1/PBS处理的miR-206不同表达水平HemSCs TGFβ/Smad信号通路蛋白、VEGF/VEGFR2、以及EMT相关蛋白的表达情况。(3)通过双荧光素酶报告基因检测miR-206与Smad4 3’UTR的结合情况。(4)通过动物模型验证miR-206对IH病程的影响。研究结果第一部分通过组织块贴壁培养+CD133免疫磁珠筛选并单克隆培养的细胞具有成管、成骨、成脂分化的能力,其生长能力旺盛,细胞表面GLUT1及CD133表达阳性、未见CD31表达,确定所分选的细胞为HemSCs。第二部分所构建的质粒经测序为pre-miR-206,将过miR-206过表达病毒及其对照病毒、miR-206干扰病毒及其对照病毒转染至HemSCs后细胞表达绿色荧光标记,经探针法检测过表达组miR-206升高了31560±734.4倍,干扰组为对照组的0.05±0.01倍。第三部分miR-206对HemSCs具有促增殖、抑制凋亡、抑制迁移,降低G1期细胞比例,增加S期细胞比例的作用,TGFβ1则具有抑制HemSCs增殖、迁移、促进HemSCs晚期凋亡的作用。第四部分miR-206靶向于TGFβ信号通路中的Smad2/3/4蛋白,最明显的为抑制Smad4蛋白表达,TGFβ信号通路与miR-206之间存在相互抑制的作用,TGFβ信号通路激活抑制miR-206的表达,miR-206反过来也能抑制TGFβ信号通路中的的关键蛋白Smad2/3/4,TGFβ信号通路激活促进HemSCs发生EMT,miR-206则抑制HemSCs细胞的EMT,表现为E-Cadherin表达增加,N-Cadherin及β-catenin表达减少。报告基因检查结果则显示miR-206通过与SMAD4 3’UTR非经典结合途径抑制其mRNA翻译成蛋白质这一过程,动物实验证实miR-206促进血管瘤脂肪化,抑制血管形成。