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Fms样酪氨酸激酶受体3配体(fms-like tyrosine kinase receptor-3 ligand，FL)是一种新近发现的、能够有效地刺激早期造血的细胞因子，可单独或联合其他细胞因子促进造血干细胞的增殖。该因子通过与其受体Flt3结合，刺激造血干细胞的增殖和分化，增加淋巴细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞及体外长期培养的干细胞等细胞的数量。在临床应用上，适合用作造血干细胞动员剂、免疫佐剂及肿瘤的免疫治疗。临床前实验表明，FL用于造血干细胞移植可有效地扩增体内的造血干细胞，提高机体对肿瘤细胞的主动免疫能力，为肿瘤临床免疫治疗提供了一种更为有效的治疗手段。因而构建高效表达重组FL蛋白的基因工程菌株，并进一步获取大量的重组FL蛋白，具有重要的科研价值和临床应用意义。因此，我们构建了高效分泌表达FL的毕赤氏酵母工程菌株。 为了提高外源基因的表达量，我们根据毕赤氏酵母偏爱密码子人工合成了编码FL胞外区156个氨基酸的cDNA序列，目的序列被定向克隆到酵母分泌型表达载体pPIC9K质粒上，构建pPIC9K-FL表达质粒。然后将pPIC9K-FL质粒采用Bg1Ⅱ酶切线性化之后，电激转化组氨酸缺陷型毕赤氏酵母KM71感受态。转化酵母接种于MD平板，筛选组氨酸回复突变株。回复突变菌株进一步采用G418梯度筛选，选取具有最高G418抗性的阳性菌落，命名为KM71pPIC9K-FL。KM71pPIC9K-FL菌株小量培养后，以0.5％甲醇诱导外源基因表达。我们提取了KM71pPIC9K-FL转化菌株的基因组DNA进行Southern实验，检测目的基因的整和插入；提取总RNA，进行了Northern实验，检测FL基因在转化菌株中的表达。KM71pPIC9K-FL菌株经发酵罐大量培养后，采用SDS-PAGE电泳和Western印迹分析了培养液上清并采用脱糖基酶PNGase F不完全酶切实验检验了毕赤氏酵母表达产物的糖基化。我们采用体外扩增CD34~+细胞的方法初步检测了毕赤氏酵母表达重组FL的生物活性。 天津医科大学博士研究生论文 我们根据毕赤氏酵母偏爱密码子人工合成的FL胞外区cDNA序列经测 序，目的片段的编码序列完全正确。重组FL胞外区CDNA以粘性末段连接方 式定向克隆至 pPICgK质粒的 EcoR和 Not酶切位点，插入到质粒中的口 －MF分泌信号序列之后。重组质粒pPICgKfL经测序，插入片段大小、位置 完全正确。Southern杂交实验结果证实目的基因己整和插入到宿主菌KM71 的基因组内。Northern杂交实验结果表明KM71pPICgKfL菌株中经0．5％甲 醇诱导后，目的基因己成功表达，而且目的基因表达量随诱导时间延长而增加。 经0．5％甲醇诱导表达后，培养液上清中检测到表达产物。Western杂交实验出 现了可被抗体特异性识别的杂交带，证实此条带即为重组毕赤氏酵母 KM7lpPICgKIL分泌表达的重组FL蛋白。SDSIAGE电泳结果显示， KM71pPICgKIL菌株表达的重组FL蛋白分子量大约为20KD。经SDSFAGE 凝胶扫描半定量分析，诱导表达96小时后，重组FL蛋白分泌量达到 108mg／L。 PNGase F不完全酶切处理后重组 FL蛋白依次脱除 1至 2个糖基，和未脱糖基 产物共形成三个杂交带，每个杂交带分子量相差大约IKD，提示每个糖基化 位点上大约有 6．9个糖基。目的蛋白彻底脱糖基后，分子量大约为 18 KD，与 原核表达产物大小相当。实验结果说明毕赤氏酵母KM7lPPICgKfL成功地分 泌表达了重组FL蛋白，此重组蛋白为糖蛋白，推测具有两个糖基化位点。体 外活性实验表明，毕赤氏酵母表达的重组FL蛋白可以有效地刺激造血干细胞 CD34“的增殖。 综上所述，本实验根据毕赤氏酵母偏爱密码子构建了高效分泌表达FL的 工程菌株，其分泌表达的重组FL蛋白具有与天然蛋白相似的生物学功能，为 获取大量重组FL蛋白，进一步研究FL的生物功能奠定了工作基础。