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维氏气单胞菌作为一种人-鱼共患致病菌,严重危害水产业的发展及人类的健康。SmpB(Small Protein B)蛋白是反式翻译系统的重要组成部分,能在维氏气单胞菌翻译过程中起到翻译监控及拯救滞留核糖体的作用,对维氏气单胞菌的生存及毒力因子的调控极为重要。寻找调控smpB启动子的转录因子,将利于深入研究SmpB蛋白与反式翻译系统,阐明维氏气单胞菌的致病机理,为维氏气单胞菌的减毒疫苗开发提供理论基础。本文通过生物信息学中的机器学习方法,构建预测调控smpB启动子的卷积神经网络模型,成功预测出可能与smpB启动子结合的转录因子。通过细菌单杂交、细菌基因敲除、实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR)、绿色荧光蛋白报告基因检测等实验,证明转录因子ArgR能直接结合smpB启动子区域,行使负调控smpB启动子的功能,其中转录因子ArgR的N端在与smpB启动子的结合中起到了主要作用,具体结果如下:(1)使用Python语言编写爬虫程序,搜集到已发表论文中的6242条细菌转录因子结合序列的信息。(2)利用爬虫程序搜集到的数据与机器学习技术,构建出可用于预测转录因子与细菌启动子结合的卷积神经网络模型,准确率达到90%。通过输入smpB启动子序列的Fasta文件,计算其结合概率,获得概率最高的五个转录因子分别为ArgR(0.213)、CueR(0.155)、OxyR(0.141)、IscR(0.076)和 OmpR(0.059)。(3)将smpB的启动子构建到pBXcmT载体上,得到了 pBXcmT-PsmpB载体。再将预测到可能与smpB的启动子互作的五个转录因子基因argR、cueR、oxyR、iscR、ompR分别构建到 pTRG 载体上,得到 pTRG-ArgR、pTRG-CueR、pTRG-OxyR、pTRG-IscR、pTRG-OmpR五个载体,测序结果证明载体均构建成功。(4)使用 pBXcmT-PsmpB载体分别与 pTRG-ArgR、pTRG-CueR、pTRG-OxyR、pTRG-IscR、pTRG-OmpR 五个载体共转化到E.coli XLl-Blue MR(Reporter)菌株中,进行细菌单杂交实验。筛选平板结果显示,在12mM3-AT(3-氨基-1,2,4-三氮唑)的筛选条件下,pTRG-ArgR载体与pBXcmT-PsmpB载体共转化的Reporter菌株能生长,证明了转录因子ArgR可以较强的结合于smpB启动子区域。(5)成功在野生型维氏气单胞菌(WT)基因组中敲除了argR,得到维氏气单胞菌argR敲除型(ΔargR):然后进行了回补实验,得到维氏气单胞菌argR回补型(::argR);敲除型与回补型均进行了测序确认。(6)测定了 WT、AargR及::argR及的生长曲线,结果显示ΔargR相对于WT生长速率更快,而::argR的生长速率缓慢,证明转录因子ArgR对维氏气单胞菌的生长是抑制作用。(7)为了研究转录因子ArgR对smpB启动子的调控方式,利用实时定量PCR技术,分别在LB培养基(Luria-Bertani培养基)、5 mM Mg2+的LB培养基、5 mM Ca2+的LB培养基的条件下,测定了 WT、AargR与::argR在对数期和稳定期的smpB表达量;结果显示,在对数期smpB表达量ΔargR显著高于WT,而稳定期的差异不显著;证明在对数期转录因子ArgR可以直接或间接的负调控smpB启动子。(8)为了检测转录因子ArgR对smpB启动子是否存在直接作用,将smpB启动子与增强型绿色荧光蛋白(eGFP Enhanced Green Fluorescent Protein)构建到pUC19载体上,得到融合荧光载体pUC19-PsmpB-eGFP;再将pUC19-PsmpB-eGFP与含有ArgR全长蛋白的pBT-ArgR载体共转化到Reporter菌株中,观测到荧光值出现显著的下降,证明转录因子ArgR可以直接负调控smpB启动子。(9)为了进一步阐明转录因子ArgR与smpB启动子的作用区域,将ArgR的C端截短体载体pBT-ArgRAC246、N端截短体载体pBT-ArgRAN245,分别与融合荧光载体pUC19-PsmpB-eGFP共转化到Reporter菌株中,均观察到荧光值发生了显著下降,其中ArgR的C端截短体的荧光值下降幅度大于N端截短体,证明转录因子ArgR的N端可能在与smpB启动子序列的结合过程中起到了更重要的作用。(10)为了更深入的考察转录因子ArgR与smpB启动子的作用位点,将smpB启动子与eGFP构建到pACYCDuet-1载体并测序,得到pACYCDuet-1-PsmpB-eGFP载体,分别与 pTRG-ArgR-G134、pTRG-ArgR-D121、pTRG-ArgR-SR54,55(实验室前期已构建)共转化到Reporter菌株,均观察到荧光值没有显著差异,说明这三个氨基酸突变位点不是关键作用位点。本研究首次在维氏气单胞菌中使用卷积神经网络,预测了能与启动子结合的转录因子并进行了实验验证,避免了传统文库筛选过程中巨大的工作量,对于维氏气单胞菌转录因子调控启动子的后续研究具有一定的理论意义和实践意义。