论文部分内容阅读
高等植物脂质转运蛋白(LTP,lipid transfer protein)是一种小分子碱性蛋白。有研究表明LTP家族基因不仅参与细胞壁的松动还可以响应环境胁迫应答。因此本研究克隆并筛选耐盐相关的白桦(Betulaplatyphylla Suk)LTP基因,并且初步分析其在抵抗盐胁迫中的功能,获得以下结果:通过白桦全基因组比对分析筛选获得了 6条具有完整ORF的LTP基因序列,命名为BpLTP1-6。生物信息学分析结果显示BpLTP1-6编码区序列长度在350bp-400bp,均具有LTP家族的结构域。BpLTP家族蛋白均为疏水性蛋白,蛋白高级结构预测分析显示该家族蛋白由α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲相互盘绕、折叠三维构象。BpLTP家族启动子含有 ABRE、G-Box、MBS、TAC-element 等多种元件。利用实时荧光定量PCR和亚细胞定位研究BpLTP基因及蛋白的表达模式。结果显示LTP家族基因在叶中表达量普遍高于茎和根,仅有BpLTP3在茎中表达高于其它组织。6条基因对盐胁迫响应程度和时间不同,但都受到盐胁迫的诱导。BpLTP1、2、5基因受甘露醇胁迫诱导,BpLTP3、4、6基因受甘露醇处理负调控。BpLTP1、2、3基因受GA3的负调控,BpLTP5是早期响应GA处理基因,BpLTP6受GA3处理的强烈诱导。亚细胞定位结果显示BpLTPs蛋白均定位在细胞膜上表达。利用烟草转基因胁迫试验分析异源转化下BpLTP基因的耐盐功能。将胁迫响应的BpLTP4基因利用农杆菌介导的叶盘法转入烟草获得过表达转基因株系。150 mM NaCl胁迫处理后对转基因株系及野生型对照进行发芽率、根长、组织化学染色和生理生化指标测定。结果显示:盐胁迫处理后转基因株系烟草种子的发芽率高于WT,转基因株系幼苗根长生长量比对照大。DAB、NTB、Evans Blue的染色结果显示转基因株系与对照相比着色浅,过表达株系POD及SOD活性高于对照,说明转基因株系清除活性氧(ROS)能力升高,ROS积累减少,细胞受损害程度轻。说明BpLTP4异源转化烟草能够提高转基因烟草的耐盐能力,BpLTP4具有一定的耐盐功能。利用农杆菌介导的瞬时转化法研究同源转化BpLTP基因的耐盐功能。将pROK Ⅱ-B pLTP3,pROKⅡ-BpLTP4载体瞬时转化白桦后进行NaCl胁迫处理,将瞬时转化株系及野生型对照进行组织化学染色和生理指标测定。组织化学染色结果显示:盐胁迫处理后B pLTP3的DAB、Evans Blue的着色较WT深,NBT着色差别不明显。NaCl胁迫处理后,BpLTP4的DAB、Evans Blue的着色较WT浅。生理生化指标测定结果显示:BpLTP3过表达株系POD及SOD活性与野生型相近;BpLTP4过表达株系POD及SOD活性高于对照;说明BpLTP4能够提高白桦瞬时转化株系的耐盐能力,具有耐盐功能。BpLTP3基因不具有耐盐功能,在白桦响应盐胁迫的反应中起负调控作用。本研究为进一步分析白桦LTP家族基因的功能提供理论数据,并为培育耐盐转基因白桦提供了材料。