肌肉是由不同类型的肌纤维构成,根据肌球蛋白重链的不同可将肌纤维类型分为I型、IIa型、IIb型和IIx型等四种。四种不同肌纤维在肌肉中所占比例的变化影响着肌肉的品质,因此研究不同肌纤维类型之间的转化对改良肌肉的品质具有重要意义。FHL3蛋白是LIM蛋白家族一员,本课题组前期研究表明在C2C12成肌细胞中超表达FHL3基因可抑制MyHC I基因的表达,促进MyHC IIa和MyHC IIb基因的表达,但在活体水平FHL3基因对不同肌纤维类型的影响仍不清楚。本研究以肌肉超表达FHL3转基因小鼠为模型,在活体水平上验证了该基因对不同肌纤维类型形成的影响。具体研究结果如下:1.构建了pEGFP-N1L-MCK-FHL3肌肉特异表达的转基因载体,利用PCR技术成功筛选获得FHL3阳性转基因小鼠,采用Q-PCR法和热不对称交错式PCR法检测了F0、F1代阳性小鼠外源FHL3基因拷贝数及F0代51号小鼠FHL3基因的插入位点,结果表明外源基因FHL3是以连续多个拷贝的方式插入小鼠基因组内,且51号个体FHL3基因插入在小鼠4号染色体内。2.统计了F0代小鼠窝产仔数、F1代小鼠阳性率以及生长曲线,结果表明F0代转基因母鼠的窝产仔数显著高于野生母鼠,F0代转基因公鼠所产后代阳性率显著低于F0代转基因母鼠所产后代的阳性率,2-8周龄转FHL3基因公鼠和母鼠的体重与野生公鼠和母鼠的体重无显著差异。3.利用Q-PCR方法检测了FHL3基因在2月龄转基因小鼠和野生小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、胃、脂肪、肌肉、睾丸等组织中的表达量,结果表明转FHL3基因小鼠的心肌、骨骼肌、睾丸中,FHL3基因的mRNA表达量显著高于野生鼠。4.对2月龄小鼠股四头肌进行石蜡包埋、切片、HE染色,利用Image J软件对股四头肌肌纤维数目和横截面积分别进行统计,统计结果显示转FHL3基因小鼠的肌纤维数目和横截面积与野生鼠相比均无显著差异。5.提取2月龄转FHL3基因小鼠和野生小鼠腓肠肌组织的RNA和蛋白,利用Q-PCR和Western blotting技术分别检测了FHL3、MyHC I、MyHC IIa、MyHC IIb等基因的mRNA和蛋白的表达水平,结果表明转基因小鼠中FHL3、MyHC IIa、MyHC IIb基因的mRNA和蛋白表达量显著高于野生鼠,MyHC I基因的mRNA和蛋白表达量显著低于野生鼠。6.利用ATP酶染色和SDH染色区分2月龄小鼠比目鱼肌和股四头肌中的不同肌纤维类型,与非转基因小鼠相比,转基因小鼠I型纤维显著降低,II型纤维显著上升。综上所述,本研究利用转FHL3基因小鼠模型,验证了FHL3可负调控MyHC I基因的表达,正调控My HC IIa和MyHC IIb基因的表达,从而导致I型肌纤维降低,II型肌纤维增多。本研究在活体水平上阐明了FHL3基因对不同肌纤维类型的影响,为改善动物肉质品质提供了一定的理论基础。