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背景：淋巴道转移是上皮来源恶性肿瘤转移的早期阶段，其发生机制不清。我们采用定量蛋白质组学技术和基因芯片对来源于同一亲本细胞系，具有基本相同遗传背景但淋巴道转移力不同的一对小鼠肝癌细胞Hca-F和Hca-P（Hca-F>75%、Hca-P<25%）的前期研究结果表明：膜联蛋白A3（Annexin A3，Anxa3）在Hca-F中上调2.3倍。Anxa3是膜联蛋白家族的一员，属于Ca2+依赖性磷脂结合蛋白。近年来的研究表明，Anxa3的表达异常与卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、结直肠癌、胰腺癌有密切关系，但具体机制不清，Anxa3可能在促进淋巴道转移方面发挥作用。本研究采用RNAi技术，探索Anxa3表达下调对小鼠肝癌细胞Hca-F恶性行为的影响。目的：1、构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3表达载体，稳定转染至Hca-F细胞，得到Anxa3基因表达明显下调的Hca-F细胞株（shRNA-Anxa3-Hca-F）。2、研究在Anxa3基因表达下调之后，Hca-F细胞增殖、粘附、迁移、侵袭、细胞周期、凋亡和细胞形态等的变化，探讨Anxa3基因对小鼠肝癌细胞生物学行为的影响。方法：1：根据Anxa3基因序列，设计3个针对Anxa3不同靶点的shRNA干扰序列，分别命名为pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3-175、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3-380、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3-874，同时设计无关序列作为阴性对照。构建好每组质粒用BamH I酶、Pst I酶分别进行酶切鉴定和序列测定。将构建好的针对3个不同靶点的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3表达载体和无关序列阴性对照载体分别用阳离子聚合物SofastTM基因转染试剂稳定转染至Hca-F细胞，24小时后荧光显微镜下观察转染效率，然后用含400μg/ml的G418完全培养基筛选21天，获得pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3表达载体和无关序列阴性对照载体稳定转染的Hca-F细胞。提取Hca-F细胞、稳定转染无关序列阴性对照载体的Hca-F细胞、稳定转染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3三个不同靶点表达载体的Hca-F细胞的RNA和蛋白质，采用qRT-PCR和Western blot技术分别在mRNA和蛋白质水平检测Anxa3基因的表达。确定抑制效果最明显的干扰序列用于后续实验。2：pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3-380载体对Hca-F细胞Anxa3的干扰效率最高，命名为shRNA-Anxa3-Hca-F。shRNA-Anxa3-Hca-F细胞、转染无关序列的阴性对照Hca-F细胞和正常Hca-F细胞三组细胞用于后续实验。应用CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖；应用体外细胞粘附试剂盒CytoSelectTM48-Well Cell Adhesion Assay检测各组细胞对细胞外基质的五种组分的粘附能力，并检测各组细胞对小鼠淋巴结的粘附能力；应用Transwell小室法测定和比较各组细胞迁移能力和侵袭能力；应用流式细胞术检测各组细胞细胞周期和细胞凋亡的情况。结果：1、重组质粒酶切和测序鉴定结果，均与设计序列完全相符，所含目的基因序列准确无误，表明重组质粒构建成功。qRT-PCR和Western blot结果显示，与正常Hca-F细胞相比，pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3-380载体对细胞中Anxa3的mRNA和蛋白敲降效率分别为72%和50%。2、CCK-8检测结果显示，Anxa3基因表达下调后，细胞生长抑制率为25%；形态学观察发现：细胞分散生长，细胞边缘变得凹凸不平；Anxa3基因表达下调以后，细胞周期没有变化，但细胞早期凋亡数量显著增加。结合细胞形态分析，Anxa3下调造成Hca-F细胞膜外翻，使磷脂酰丝氨酸外露，膜的稳定性下降。Anxa3下调，Hca-F细胞迁移和侵袭能力分别下降48%和67%；粘附实验结果显示：与Hca-F组细胞相比，shRNA-Anxa3-Hca-F细胞对淋巴结的粘附能力明显下降72.2%；对细胞外基质CollagenⅠ的粘附能力下降36.5%。结论：1、成功构建了三条pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3表达载体和含有无关序列的阴性对照质粒，并稳定转染至Hca-F细胞中，确定干扰效率最高的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3-380表达载体稳定转染Hca-F细胞作为后续功能研究的对象。2、Anxa3的表达下调可抑制Hca-F细胞的增殖，不影响其细胞周期；Anxa3的下调可使细胞膜的稳定性下降，导致膜发生外翻，致使Hca-F早期凋亡细胞明显增加；Anxa3的表达下调可降低Hca-F的细胞迁移和侵袭能力，明显降低其对小鼠淋巴结的粘附能力，使其对细胞外基质CollagenⅠ的粘附能力降低64%。